Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp áp dụng để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ và vẽ biểu đồ
- Phương pháp điều tra dịch tễ học hồi cứu, dựa vào số liệu của Cục thống kê, Chi cục Trồng trọt và Chăn nuôi tỉnh Cao Bằng:
+ Báo cáo tình hình chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Cao Bằng
+ Báo cáo nhanh theo ngày, theo tháng, quý, báo cáo năm về tình hình Dịch tả lợn Châu Phi tại Cao Bằng
+ Điều tra nghiên cứu trực tiếp thông qua phiếu điều tra tại các huyện trong tỉnh Cao Bằng (mẫu phiếu điều tra theo Phụ lục 1)
- Tập hợp xử lý số liệu để xây dựng bản đồ dịch tễ
2.3.2. Phương pháp xét nghiệm mẫu
Để xác định virus DTLCP: dùng huyết thanh và mẫu bệnh phẩm (hạch lâm ba, phủ tạng như lách, thận...) của lợn nghi mắc bệnh DTLCP
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh:
- Trước khi lấy máu con vật, sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn 70o. Dùng bơm tiêm đã được tráng chất chống đông EDTA 0,5% hoặc Heparin hút 3 ml máu từ tĩnh mạch cổ lợn đang ốm, sốt, sau đó hút pittong ra đến 5 ml, bẻ gập đầu kim và đậy nắp kim lại, đặt nằm nghiêng 45o và để yên 1 giờ đến 2 giờ ở nhiệt độ bình thường cho máu đông.
Ly tâm lạnh ống huyết thanh, tốc độ 6.000 vòng/10 phút, chắt huyết thanh sang ống eppendorf và ghi ký hiệu mẫu lên ống. Huyết thanh đạt yêu cầu phải trong, màu hơi vàng và không có hồng cầu vỡ.
- Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
* Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm:
- Thu thập mẫu bệnh phẩm ở những con lợn chết theo hướng dẫn của Cục Thú y tại công văn số 687/TY-DT ngày 19/4/2019 và tuân thủ các quy tắc an toàn sinh học theo hướng dẫn của OIE để tiến hành xét nghiệm virus.
- Loại mẫu bệnh phẩm là các hạch lâm ba (lympho) bẹn, hạch dưới hàm hoặc phủ tạng như lách, thận.
- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 20C đến 80C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 40C đến 80C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ -200C đến -800C
2.3.2.2. Phương pháp xét nghiệm
Để phát hiện bệnh DTLCP chủ yếu dùng phương pháp realtime PCR để phát hiện virus DTLCP (King và cs., 2003).
Các bước thực hiện được trình bày theo TCVN 8400-41:2019 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi. Đoạn mồi và
mẫu dò được thiết kế dựa trên vùng ổn định của gen P72 (bảng 1, phụ lục 2) và được sử dụng với nồng độ thích hợp, như sau:
+ Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM + Đoạn dò sử dụng ở nồng độ 5 µM - Tiến hành phản ứng realtime PCR
+ Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị trên và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể áp dụng kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thức master mix).
+ Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2, phụ lục 2.
+ Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành: + Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.
+ Cho 5 µl DNA dương chuẩn của vi rút ASF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương
+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm + Cho 5 µl DNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR
+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR
* Lưu ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
+ Chu trình nhiệt chạy phản ứng theo kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 nêu trong bảng 3, phụ lục 2.
* Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
- Đọc kết quả
+ Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).
+ Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
+ Với điều kiện phản ứng:
Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40
Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct
Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.
- Đánh giá kết quả: Mẫu có virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi khi kết quả real-time PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác đ ể khẳng định kết quả.
* Quy định về loại lợn: Lợn nái, lợn thịt và lợn con - Mùa vụ: nghiên cứu ở 4 mùa vụ trong năm.
+ Mùa xuân: từ tháng 2 đến tháng 4 + Mùa hè: từ tháng 5 đến tháng 7 + Mùa thu: từ tháng 8 đến tháng 10
+ Mùa đông: từ tháng 11 đến tháng 01 năm sau
- Phương thức chăn nuôi: nghiên cứu ở 3 phương thức chăn nuôi lợn. + Phương thức truyền thống (nuôi chuồng hở, nuôi thả, tận dụng thức ăn thừa): hộ gia đình chăn nuôi với số lượng ít (chăn nuôi nhỏ lẻ).
+ Phương thức công nghiệp chuồng kín: chăn nuôi với số lượng lớn (chăn nuôi trang trại), điều kiện vệ sinh thú y tốt.
+ Phương thức công nghiệp chuồng hở: chăn nuôi với số lượng lớn (chăn nuôi trang trại), điều kiện vệ sinh thú y tốt.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của bệnh
- Kiểm tra biểu hiện lâm sàng: Chúng tôi sử dụng phương pháp chẩn đoán cơ bản là quan sát những biểu hiện của lợn như: đo nhiệt độ, biểu hiện một số vùng da dưới ngực và bụng có màu khác thường, di chuyển không vững, tiêu chảy ...
- Phương pháp xét nghiệm máu để xác định một số chỉ số huyết học của lợn bị bệnh DTCP và lợn khỏe: Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố và công thức bạch cầu của lợn bệnh và lợn khỏe được xác định bằng máy PCE 210 và XP 100 tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) tỉnh Cao Bằng.
- Phương pháp xác định bệnh tích đại thể
+ Phương pháp xác định bệnh tích đại thể: Mổ khám lợn bị bệnh DTLCP (có biểu hiện lâm sàng của bệnh DTLCP), quan sát bằng mắt thường bệnh tích tại các cơ quan nội tạng có biểu hiện đặc trưng như: lá lách, ruột, tim, hạch..., chụp ảnh những vùng có bệnh tích điển hình.
2.3.4. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh DTLCP tại tỉnh Cao Bằng
- Dựa vào tình hình thực tế tại tỉnh Cao Bằng;
- Dựa vào kinh nghiệm của các nước và khuyến cáo của các tổ chức quốc tế
- Dựa vào văn bản chỉ đạo, điều hành của chính phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn