Tổng quan về hòa tan và tái sinh fibroin tơ tằm

9. Kết cấu của luận án

1.3.4. Tổng quan về hòa tan và tái sinh fibroin tơ tằm

1.3.4.1. Hòa tan fibroin

Từ tính chất hóa học của fibroin, có thể thấy rằng fibroin có khả năng hòa tan trong bazơ, axit đặc, một số muối, chất oxi hóa và dung môi hữu cơ đặc biệt ở nhiệt độ cao thì fibroin bị phá hủy rất nhanh. Khả năng hòa tan của fibroin tơ tằm phụ thuộc vào tác nhân hòa tan, điều kiện hòa tan. Để hòa tan fibroin tơ tằm các nhà nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau như CaCl2/nước/ethanol (CWE), Ca(NO3)2/methanol/nước, LiBr, NaSCN và N-methyl morpholine N-oxide... [152, 161, 165, 166]. Năm 2004, Chandra và cộng sự [167] đã nghiên cứu quá trình hòa tan và tái sinh fibroin tơ tằm trong các hệ dung dịch khác nhau, kết quả được thể hiện trong Bảng 1.7. Sự hòa tan của fibroin trong Ca(NO3)2/MeOH và LiBr/EtOH chỉ mất 10 phút trong khi Hexafluoro-isopropanol (HFIP) và hexafluoroacetone lần lượt mất 24 giờ và 2 giờ. Ca(NO3)2/MeOH/H2O và LiBr/EtOH/H2O có khả năng hòa tan mạnh nhất cho chuỗi fibroin tơ tằm với độ nhớt gần như không đổi, trong khi LiBr/H2O (dung dịch nước LiBr 9,5M) có độ hòa tan yếu nhất với tác dụng tương tự đối với các phân tử fibroin với nước tinh khiết [167].

Bảng 1.7: Các hệ dung môi hoà tan fibroin tơ tằm [167]

Dung môi Tỷ lệ mol Thời gian hòa tan

Ca(NO3)2-MeOH 75:25 10 phút

LiBr-EtOH-H2O 45:44:11 10 phút

LiBr-EtOH 40:60 30 phút

CaCl2-EtOH-H2O 1:2:8 10 phút

LiBr- H2O 9,5M 30 phút

N-methy morpholine Nguyên chất 10 phút

HFIP Nguyên chất 24 giờ

Hexafluoroacetone Nguyên chất 2 giờ

Năm 2006, Tác giả E. S. Sashina cùng cộng sự [152] đã nghiên cứu cấu trúc và khả năng hòa tan của fibroin tơ tằm tự nhiên trong hệ nước - muối, nước - chất hữu cơ và dung môi hữu cơ. Công trình này đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đến sự hình thành tổ chức cấu trúc thứ cấp của fibroin trong dung dịch và trong chất rắn trạng thái sau khi tái sinh. Nhóm tác giả đã nghiên cứu hòa tan fibroin tơ tằm trong các hệ như LiCNS, LiBr, CaCl2, Ca(CNS)2, ZnCl2, NH4CNS, CuSO4 + NH4OH, Ca(NO3)2] và cũng đã chỉ ra những hạn chế: thời gian chuẩn bị dài (quá trình thẩm tích dung dịch có thể lên đến vài ngày), tốn năng lượng để thu hồi dung môi cho mục đích tái sử dụng, nồng độ muối trong dung dịch đạt tới mức bão hòa. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng lựa chọn hệ dung môi để hòa tan fibroin phù hợp có thể kiểm soát quá trình hình thành cấu trúc thứ cấp của fibroin trong dung dịch và sau khi tái sinh. Khi thêm dung môi phân cực (cồn, axeton, axit axetic...) vào dung dịch hòa tan sẽ làm cho tơ tằm dạng I (Silk I) chuyển sang cấu trúc dạng gấp khúc -folded, các liên kết hydro bị phá vỡ. Ngược lại, dung môi không phân cực hòa tan các phần kị nước của fibroin tơ tằm dẫn đến các nhóm amide, hydroxyl và các nhóm phân cực khác tương tác với nhau thông qua các liên kết hydro và do đó cố định cấu trúc -helical. Fibroin tơ tằm trong dung dịch LiBr/H2O sau khi thẩm tích có cấu trúc sắp xếp lộn

38

xộn nhưng trong dung dịch LiBr/etanol hình thành nên dạng màng thì có cấu trúc dạng lớp -sheet. Trong dung môi hexafluoroisopropanol, cấu trúc chủ yếu của fibroin là cấu trúc -helical và một phần nhỏ có cấu trúc gấp khúc -folded, được thể hiện trên Hình 1.34 [152].

Hình 1.34: Cấu trúc của fibroin tơ tằm.

(a)-helical; (b) -folded.

Năm 2014, tác giả Lawrence, B. D [158] đã nghiên cứu hòa tan fibroin tơ tằm để tạo ra vật liệu ứng dụng trong lĩnh vực y sinh ở nhiều dạng khác nhau như dạng màng, ống, hydrogel… theo quy trình thể hiện trên Hình 1.35.

Hình 1.35: Sơ đồ quy trình hoà tan fibroin tơ tằm từ kén tằm Bombyx mori.

Kén tằm sau khi chuội sạch keo sericin bằng dung dịch Na2CO3 0,02M ở nhiệt độ sôi, sau đó giặt sạch, sấy khô thu được fibroin tơ tằm. Fibroin tơ tằm được hòa tan bằng dung dịch muối LiBr 9,3M ở 60ºC trong vòng 4 giờ. Muối LiBr dư được loại bỏ thông qua quá trình thẩm tích trong trong nước sạch khoảng 48 giờ. Năm 2018, tác giả F. Costa và cộng sự [168] đã nghiên cứu vật liệu sinh học từ xơ protein để tái tạo mô. Trong nghiên cứu này kén tằm và tuyến tơ được chuội keo sericin, sau đó fibroin được hòa tan bằng dung dịch muối bão hòa LiBr 9,3M và hệ dung môi CaCl2/Ethanol/nước. Sau khi dung môi bay hơi thì fibroin được hòa tan tiếp trong 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propano và axit formic [168]. Dung dịch thu được được xử lý trong nước hoặc các dung môi khác nhau để tạo thành gel, xơ hoặc bọt biển với chức năng hóa học khác nhau. Các vật liệu này có tính tương thích sinh học tuyệt vời, khả năng phân hủy enzyme và khả năng phục hồi cơ học để ứng dụng trong lĩnh vực

(a)

(b)

(a)

39

y sinh [168]. Một nghiên cứu khác của tác giả Wang và cộng sự năm 2013 [169] đã chỉ ra ảnh hưởng của quá trình hòa tan đến khối lượng phân tử của fibroin tơ tằm tái sinh trong các hệ dung môi LiBr và CaCl2/EtOH. Kết quả nghiên cứu cho thấy với các hệ dung môi khác nhau thì thu được dung dịch fibroin có khối lượng phân tử khác nhau, trong hệ CaCl2 cho thấy dung dịch fibroin có khối lượng phân tử thấp hơn trong hệ LiBr [169].

Ngoài việc nghiên cứu sử dụng các hệ dung môi thích hợp để hòa tan fibroin thì trên thế giới còn có nhiều nghiên cứu để tăng hiệu quả hòa tan fibroin như sử dụng sóng điện từ. Năm 2018, nhóm tác giả Shouchuan Li đã nghiên cứu sử dụng vi sóng để hòa tan nhanh chóng và hiệu quả tơ tằm để tạo ra vật liệu sinh học từ fibroin. Nhóm tác giả đã lựa chọn hòa tan fibroin tơ tằm bằng hệ Ca(NO3)2/Etanol/H2O và CaCl2/Etanol/H2O (1:2:8) với sự hỗ trợ của sóng điện từ. Nghiên cứu này cho thấy hiệu quả hòa tan fibroin nhanh hơn (đối với phương pháp thông thường kéo dài hơn 2 giờ), tiết kiệm hơn 90% năng lượng và thuận tiện hơn nhiều so với phương pháp thông thường. Phân tích phổ FTIR, SDS-PAGE, phân tích axit amin và keo hóa cho thấy thuộc tính của fibroin tái sinh cũng tương tự như đối với phương pháp hòa tan thông thường [165].

1.3.4.2. Tái sinh fibroin tơ tằm

Để tái sinh fibroin, cần loại bỏ muối hoặc dung môi dư sau quá trình hoà tan bằng phương pháp thẩm tích [152, 158, 160, 168, 170] hoặc sử dụng hệ dung môi để tái sinh trực tiếp [159]. Năm 2018, nhóm tác giả Mehrabani [171] đã nghiên cứu tạo ra vật liệu băng vết thương kháng khuẩn từ fibroin tơ tằm, chitin, nano bạc có tính tương thích sinh học và có thể phân hủy sinh học. Để chuẩn bị dung dịch fibroin tơ tằm cho nanocomposit này thì nhóm tác giả đã tiến hành hòa tan fibroin tơ tằm bằng hệ muối CaCl2/Etanol/H2O ở 70ºC trong vòng 4 - 5 giờ. Dung dịch thu được thẩm tích trong khoảng thời gian 4 ngày trong nước khử ion để loại bỏ muối. Dung dịch thu được sau thẩm tích được ly tâm 3 lần ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, cuối cùng thu được dung dịch fibroin tơ tằm. Hình 1.36 thể hiện các bước để chuẩn bị dung dịch fibroin tơ tằm [171]. Thông thường quá trình thẩm tích kéo dài khoảng 3 - 4 ngày. Nhóm tác giả đã sử dụng màng thẩm tích để tách các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 3,5 kDa, muối LiBr, etanol dư và thu được dung dịch fibroin có khối lượng phân tử từ 25 - 39 kDa. Sau đó để tái sinh fibroin, nghiên cứu đã sử dụng dung môi methanol [158]. Một phương pháp khác để loại bỏ muối còn dư sau quá trình hòa tan fibroin được nhóm tác giả Ha Thanh Ngo nghiên cứu năm 2017 [166]. Trong nghiên cứu này, tác giả đã thực hiện hòa tan fibroin tơ tằm bằng dung dịch CaCl2/Etanol/H2O. Vải cellulose và poliamide được ngấm ép dung dịch fibroin tơ tằm, sấy khô ở 105ºC trong vòng 5 phút. Ở bước kế tiếp, vải được ngấm trong dung dịch K2CO3 nhằm loại bỏ bớt Ca2+ còn dư giúp cho quá trình tái sinh ở bước tiếp theo tốt hơn. Và cuối cùng vải được xử lý bằng dung dịch metanol để fibroin tơ tằm lắng đọng trên bề mặt vải. Cơ chế tái sinh fibroin được thể hiện trên Hình 1.37 [166].

40

Hình 1.36: Các bước để chuẩn bị dung dịch fibroin tơ tằm [171].

Hình 1.37: Cơ chế tái sinh fibroin tơ tằm [166].

Tùy theo mục đích sử dụng mà fibroin được tái sinh thành các dạng khác nhau như kéo sợi, tạo màng, làm vật liệu nền nuôi cấy tế bào, hay tẩm phủ lên các vật liệu dệt khác [152, 160, 170, 172]. Gần đây xu hướng sử dụng dung dịch fibroin để xử lý cho vật liệu cellulose cũng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [159, 166, 173- 175]. Năm 2017, nhóm tác giả Ha Thanh Ngo và Thomas Bechtold [166] đã nghiên cứu biến tính bề mặt vải viscose và polyamide bằng cách tạo lớp màng fibroin tơ tằm tái sinh. Trong nghiên cứu này tác giả đã thực hiện hòa tan tơ tằm bằng dung dịch muối Canxi clorua/Nước/Etanol (CWE) theo tỷ lệ mol là 1:8:2. Dung dịch fibroin hòa tan được đưa lên vải viscose và polyamide bằng phương pháp ngấm ép. Nghiên cứu cho thấy sự lắng đọng của fibroin trên vải dẫn đến những thay đổi về tính chất cơ học của các mẫu đã xử lý như làm cứng hơn do độ linh động của các sợi trong vải bị giảm do lớp phủ thêm vào. Các mẫu đã được xử lý đã giảm đáng kể điện trở suất bề mặt, do đó cho thấy tiềm năng của các màng fibroin như vậy sẽ được phát triển hơn nữa để hoàn thiện chống tĩnh điện cho vải dệt tổng hợp. Một số nghiên cứu khác [159, 173, 175, 176] cho thấy xử lý hoàn tất cho vải cotton bằng fibroin tơ tằm giúp cải thiện một số tính chất của vật liệu như góc hồi nhàu, khả năng hút ẩm của vải. Màng fibroin hình thành trên bề mặt vải len sẽ giảm vón hạt trên bề mặt vải [174].

Kén tằm Chuội keo sericin Fibroin tơ tằm

Dungdịch fibroin CaCl2/Ethanol/H2O Thẩm tích dung dịch fibroin (4 ngày) Dung dịch fibroin tơ tằm

41

Tình hình nghiên cứu hòa tan và tái sinh fibroin tơ tằm trong nước cho đến nay mới chỉ có công trình nghiên cứu của tác giả Trần Bích Lam năm 2010 [177] công bố về tách fibroin tuyến tơ chế tạo màng polymer sinh học. Nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành tách fibroin khỏi màng bao tuyến tơ bằng enzym papain và axit citric 5%, hòa tan fibroin bằng enzym trypsin 0,03% trong dung dịch NH4OH 0,6%; tạo màng theo phương pháp đổ khuôn và nghiên cứu tính chất của màng fibroin. Khả năng ứng dụng màng fibroin vô khuẩn thay thế da nhân tạo trong điều trị bỏng, vết thương do mất da [177].

1.3.4.3. Phương pháp xác định đặc tính của fibroin

Để tạo ra dung dịch fibroin từ kén tằm phải trải qua quá trình chuội keo sericin, hòa tan và tái sinh fibroin. Đặc tính của fibroin qua các quá trình xử lý được xác định thông qua trạng thái lưu biến, phổ FTIR, SEM của fibroin qua các quá trình xử lý [158, 166, 172]. Năm 2011 nhóm tác giả Chen Xin [172] đã nghiên cứu fibroin tơ tằm Bombyx mori bằng phổ FTIR và đo lưu biến. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra trạng thái lưu biến của dung dịch fibroin tơ tằm 2% trong các dung môi khác nhau Ca(NO3)2/MeOH/H2O, LiBr/EtOH/H2O, CaCl2/EtOH/H2O và LiBr/H2O. Phân tích phổ FTIR của màng fibroin tái sinh từ quá trình thẩm tích LiBr/H2O cho thấy các peak đặc trưng 1654 cm-1 (amin I), 1532 cm-1 (amin II), 1238 cm-1 (amin III). Các peak đặc trưng của fibroin tơ tằm tái sinh từ Ca(NO3)2/MeOH/H2O, LiBr/EtOH/H2O, CaCl2/EtOH/H2O là 1657 cm-1, 1651 cm-1 (amin I), 1535 cm-1 (amin II), 1238 cm-1

(amin III). Fibroin tái sinh từ LiBr/H2O có peak của amin I là 1654 cm-1 được chia thành hai là 1657 cm-1, 1651 cm-1, các peak đặc trưng khác gần như không đổi. Điều này chứng tỏ rằng dường như không có sự khác nhau khi tái sinh fibroin trong các hệ dung môi đề cập ở trên [172].

Năm 2017, nhóm tác giả Ha Thanh Ngo đã nghiên cứu biến tính bề mặt vật liệu dệt bằng cách lắng đọng lớp fibroin tơ tằm tái sinh [166]. Tác giả đã phân tích phổ FTIR của vải viscose, polyamide trước và sau khi xử lý bằng fibroin tơ tằm, thể hiện trên Hình 1.38. Những peak đặc trưng của nhóm amin I (1680 - 1630 cm-1), amin II (1570 - 1515 cm-1) và amin III (1300 - 1200 cm-1) của xơ fibroin tái sinh xuất hiện trong phổ FTIR tương ứng.

Hình 1.38: Phổ FTIR của mẫu vải trước và sau khi xử lý bằng fibroin tơ tằm [166]. (a) Mẫu vải viscose, (b) mẫu vải Polyamit.

Để đánh giá khả năng tái tạo màng fibroin tơ tằm trên bề mặt vải, các nghiên cứu đã sử dụng kính hiển vi quang học (OM) và kính hiển vi quét (SEM), xác định hàm lượng nitơ có trên vải bằng phương pháp Dumas, Kjeldahl; phương pháp nhuộm màu để xác định sự có mặt của fibroin [159, 166]. Ngoài ra, tác giả còn đánh giá tính

42

chất vật lý của vật liệu dệt được biến tính bằng fibroin tơ tằm thông qua các tính chất độ cứng, độ dài uốn, điện trở suất bề mặt, và tính thoáng khí [166].

Ngoài ra để hiểu rõ hơn về trạng thái của fibroin trong dung dịch hòa tan để tăng khả năng tái sinh của fibroin trên nền vật liệu khác thì năm 2018 nhóm tác giả Thomas Bechtold đã nghiên cứu phân tích trạng thái của fibroin trong dung dịch Canxi clorua/Nước/Etanol (CWE) để cải thiện quá trình tái sinh fibroin [139]. Thử nghiệm chuẩn độ điện thế của trạng thái hòa tan giúp hiểu rõ trạng thái của dung dịch fibroin làm cơ sở cải thiện quá trình tái sinh.

Qua tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về hòa tan, tái sinh fibroin tơ tằm cho thấy fibroin tơ tằm có thể hòa tan trong nhiều hệ dung môi, trong đó hệ dung môi LiBr cho thấy hiệu quả hòa tan cao, có thể hòa tan một lượng lớn fibroin tơ tằm trong vòng 1 - 2 giờ và hệ CaCl2 cũng có khả năng hòa tan fibroin tốt, giá thành rẻ nhưng điều kiện hòa tan phức tạp hơn là ở nhiệt độ cao và phải có khuấy lắc. Hơn nữa, đối với mỗi loại tằm khác nhau thì khả năng hòa tan cũng khác nhau và dung dịch fibroin thu được cũng khác nhau. Để loại bỏ muối, dung môi còn lại sau quá trình hòa tan và tái sinh fibroin cũng có rất nhiều phương pháp như: (1) thẩm tích: là kỹ thuật tách các hợp chất của phần tử nhỏ khỏi các hợp chất của phần tử lớn nhờ khuyếch tán chọn lọc qua màng, quá trình này thường kéo dài từ 3 - 4 ngày; (2) sử dụng các muối và dung môi: quá trình này thực hiện nhanh hơn thẩm tích nhưng phải sử dụng nhiều hóa chất. Tùy theo ứng dụng của fibroin tái sinh vào mục đích gì để lựa chọn phương pháp phân tích đặc tính của fibroin tơ tằm tái sinh phù hợp, các phương pháp thường được sử dụng là SEM, FTIR, Kjeldahl, Dumas...