9. Kết cấu của luận án
3.1.1.Sử dụng dịch chiết quả Bồ hòn làm chất khử
3.1.1.1. Kết quả chiết tách và tổng hợp nano bạc
a. Hàm lượng saponin có trong dịch chiết quả Bồ hòn
Các nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết quả Bồ hòn chứa các hợp chất như saponin, flavonoid, carbohydrate… có khả năng khử ion bạc thành nano bạc [88, 90]. Mặc dù khó có thể khẳng định chất nào đóng vai trò là chất khử chính trong quá trình tổng hợp AgNPs nhưng các hợp chất này đều có khả năng khử ion bạc và đồng thời là chất ổn định và chất bảo vệ AgNPs tạo thành [88-90]. Trong đó, saponin, một chất hoạt động bề mặt sinh học chiếm hàm lượng lớn có trong dịch chiết quả Bồ hòn, có vai trò chính là ổn định AgNPs tạo thành. Tuy nhiên, hàm lượng các chất có trong dịch chiết quả Bồ hòn phụ thuộc vào thổ nhưỡng, thời gian thu hoạch, phương pháp chiết xuất… [81, 205]. Vì vậy, xác định hàm lượng các hợp chất này, đặc biệt là saponin trong dịch chiết quả Bồ hòn đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng yếu tố khử trong quá trình tổng hợp nano bạc.
Trong nghiên cứu này, hàm lượng saponin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp chiết trong dung môi metanol. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1. Dịch chiết quả Bồ hòn sau đó được pha loãng đến nồng độ saponin đạt 0,5 g/l dùng để tổng hợp nano bạc.
Bảng 3.1: Hàm lượng saponin có trong dịch chiết quả Bồ hòn
Hàm lượng saponin trong chất rắn chiết được (%mSa)
Hàm lượng Saponin trong dung dịch CSa (g/l)
86,5 0,8 54,3 3,3
b. Ảnh hưởng của nồng độ AgNO3
Để xác định được điều kiện tối ưu tổng hợp nano bạc, luận án sử dụng phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để đánh giá sự hình thành, sự ổn định, hình thái của nano bạc khi thay đổi điều kiện tổng hợp. Trong nghiên cứu này, tác giả tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc nitrat (AgNO3) và thời gian phản ứng đến đặc tính hạt nano bạc tạo thành.
Ảnh hưởng của các nồng độ AgNO3 10, 20, 30, 40, 50 mM tới quá trình tổng hợp nano bạc được khảo sát ở các điều kiện phản ứng: nhiệt độ 50℃, thời gian 12 giờ, nồng độ saponin 0,5 g/l, các điều kiện khác không thay đổi. Hình 3.1 thể hiện sự biến đổi màu sắc và kết quả đo UV-Vis của dung dịch trong quá trình tổng hợp nano bạc khi thay đổi nồng độ AgNO3. Ta thấy, hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu vàng nâu là do hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR: Surface plasmon resonance) của nano bạc tạo thành [63, 206, 207]. Các mẫu dung dịch nano bạc sau quá trình tổng hợp được ly tâm, siêu âm 2 lần để loại các chất phản ứng (AgSa) và tiến hành đo UV-Vis.
77
Hình 3.1: Màu sắc và phổ UV-Vis của dung dịch Sa và AgSa khi thay đổi nồng độ AgNO3 phản ứng.
Kết quả đo UV-Vis trên Hình 3.1 là cho thấy dịch chiết quả Bồ hòn (Sa) không có peak hấp thụ trong khi AgSa có peak hấp thụ cực đại rõ ràng xung quanh bước sóng 428 nm. Điều này chứng tỏ có sự hình thành nano bạc do có hiện tượng SPR [88-90]. Thêm nữa, theo các tài liệu đã công bố về AgNPs tổng hợp xanh, peak xuất hiện tại bước sóng 428 nm là hiện tượng SPR của AgNPs hình cầu, có kích thước trong khoảng 10 - 30 nm [68, 88]. Từ Hình 3.1 cho thấy cường độ hấp thụ cực đại cao nhất tại bước sóng 428 nm tương ứng với nồng độ bạc nitrat là 30 mM. Khi tiếp tục tăng nồng độ AgNO3 thì cường độ peak hấp thụ giảm xuống, peak rộng hơn và dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn. Điều này là do nồng độ AgNO3 cao hơn thì tốc độ phản ứng nhanh, hạt nano bạc tạo thành có kích thước lớn hơn và số lượng ít đi [207]. Dựa trên kết quả phân tích này, luận án đã chọn nồng độ AgNO3 30 mM để khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng.
Hình 3.2: Màu sắc và phổ UV-Vis của AgSa khi thay đổi thời gian tổng hợp.
c. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Luận án đã nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng 4, 8, 12, 16 và 24 giờ đến đặc tính của hạt nano bạc được tổng hợp ở điều kiện: nhiệt độ 50℃, nồng độ
Sa 10mM 20mM 30mM 40mM 50mM 300 400 500 600 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Abso rb an ce (a .u) Wavelength (nm) SME 10 mM 20 mM 30 mM 40 mM 50 mM Cư ờn g độ hấ p thụ (a.u) Bước sóng (nm) Sa
0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 24 giờ
300 400 500 600 700 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Abso rb an ce (a .u) Wavelength (nm) 4 h 8 h 12 h 16 h 24 h Cư ờn g độ hấ p thụ (a.u) Bước sóng (nm)
78
AgNO3 30mM, nồng độ saponin 0,5 g/l, các điều kiện khác không thay đổi. Hình 3.2 thể hiện sự biến đổi màu sắc và phổ UV-Vis của dung dịch AgSa trong quá trình tổng hợp nano bạc theo thời gian. Kết quả cho thấy sự xuất hiện peak hấp thụ cực đại tại bước sóng 425 nm sau 4 giờ phản ứng. Khi tăng thời gian phản ứng lên đến 12 giờ, peak hấp thụ cực đại hẹp hơn và cường độ peak tăng dần. Tuy nhiên, khi thời gian phản ứng tiếp tục tăng đến 24 giờ thì cường độ peak hấp thụ tăng chậm lại và bước sóng hấp thụ cực đại dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn từ 425 nm đến 430 nm. Hiện tượng này có thể do kích thước của nano bạc tăng lên hoặc chúng kết tụ với nhau [207]. Từ kết quả phân tích này, luận án đã chọn thời gian phản ứng là 12 giờ là phù hợp nhất trong giới hạn nghiên cứu.
Dựa trên kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 và thời gian phản ứng, luận án đã xác định được điều kiện tổng hợp AgSa tối ưu là nhiệt độ 50℃, thời gian 12 giờ, nồng độ AgNO3 30 mM và dịch chiết quả Bồ hòn có nồng độ saponin 0,5 g/l. Điều kiện này được sử dụng để tổng hợp nano bạc cho các phân tích đánh giá tiếp theo.
3.1.1.2. Đặc tính của hạt nano bạc AgSa
Nano bạc AgSa được tổng hợp ở điều kiện phản ứng đã chọn và khảo sát đặc tính hình thái, kích thước hạt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua HR-TEM. Ảnh HR-TEM của AgSa ở mức độ phóng đại 100k và 800k và biểu đồ phân bố kích thước hạt (Hình 3.3a-c) cho thấy các hạt nano bạc có dạng hình cầu, kích thước từ 10 - 25 nm và kích thước trung bình của hạt là 17,3 nm. Kết quả này phù hợp với nhận định trong phân tích UV-Vis và các tài liệu đã được công bố về tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh [44, 91]. Saponin là chất hoạt động bề mặt tự nhiên, thành phần chính trong dịch chiết quả Bồ hòn, nên có khả năng bao bọc các hạt nano bạc tạo thành. Điều này không chỉ giúp kiểm soát được tốc độ phản ứng mà còn hạn chế sự kết tụ của các hạt nano bạc do quá trình va chạm. Vì vậy, hạt AgSa thu được sau quá trình tổng hợp phân tán tốt và ổn định trong dung dịch.
Hình 3.3: Ảnh TEM của AgSa và biểu đồ phân bố kích thước hạt. (a)×100k và (b) ×800k và (c) biểu đồ phân bố kích thước của hạt AgSa.
Để xác định cấu trúc tinh thể của nano bạc tổng hợp được, luận án thực hiện phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Hình 3.4a là giản đồ XRD của AgSa cho thấy các peak nhiễu xạ tia X ở góc 2: 38,20°; 43,76°; 64,42° và 77,77° tương ứng với các mặt phẳng tinh thể (111), (200), (220) và (311). Kết quả phân tích này cho thấy AgSa có cấu trúc lập phương tâm mặt như các nghiên cứu đã công bố [29, 30, 71]. Điều này khẳng định nano bạc đã được tổng hợp thành công từ phản ứng giữa AgNO3 và dịch chiết quả Bồ hòn. 50.0nm 10.0nm (a) (b) (c) 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 0 3 6 9 12 15 18 Di stributio n (%) Particle size (nm) 30 25 20 15 10 5 0
79
Hình 3.4: Giản đồ XRD của AgSa (a) vàphổ FTIR của Sa và AgSa (b).
Như đã trình bày trong phần tổng quan, dịch chiết từ quả Bồ hòn chứa nhiều hợp chất hữu cơ có thể đóng vai trò là chất khử và chất ổn định trong phản ứng tổng hợp AgNPs từ muối bạc nitrat. Các hợp chất hữu cơ này chứa các nhóm chức như hydroxyl, cacboxyl, cacbonyl có tác dụng khử ion bạc có trong dung dịch bạc nitrat về dạng nano bạc. Ngoài ra, hợp chất saponin còn đóng vai trò là chất ổn định AgNPs do có cấu tạo của chất hoạt động bề mặt. Phân tích FTIR được tiến hành với hợp chất chiết từ quả Bồ hòn (Sa) và nano bạc tổng hợp được (AgSa) để chứng minh giả thiết này. Phổ FTIR của Sa (Hình 3.4b) cho thấy sự xuất hiện của các peak tại số sóng 3416,10 cm-1 đặc trưng cho các nhóm chức hydroxyl (-OH), tại 2932,93 cm-1 đặc trưng của liên kết C-H trong mạch hydrocacbon, tại 1721,81 cm-1 và 1253,74 cm-1
đặc trưng cho liên kết C=O và C-O tương ứng có trong nhóm chức este hoặc xeton. Các peak tại số sóng 1635,36 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C của vòng thơm hoặc liên kết C=O trong các axit amin, và peak tại 1044,73 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- O-C trong ete [208]. Kết quả phân tích này phù hợp với các tài liệu đã công bố về phân tích FTIR của dịch chiết quả Bồ hòn, xác nhận sự có mặt của các hợp chất khử tự nhiên có trong dịch chiết này như saponin, flavonoid, carbohydrate. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau phản ứng tổng hợp và tinh chế, sự tồn tại của các hợp chất hữu cơ trên bề mặt của hạt AgSa được thể hiện bởi các peak hấp thụ đặc trưng trên phổ FTIR của AgSa tại các số sóng 3444,20; 2919,13; 1716,10; 1622,09; 1384, 1234,10 và 1024,15 cm-1. Tuy nhiên, sự giảm cường độ peak hấp thụ và sự dịch chuyển vị trí của các peak tại số sóng 2919,13; 1716,10 và 1234,10 cm-1 của AgSa so với Sa có thể là do sự hình thành liên kết bạc-cacboxylat tương tác với mạch hydrocarbon thông qua lực kỵ nước [209]. Ngoài ra, sự tăng cường độ của peak tại số sóng 1622,09 cm-1 trên phổ của AgSa là đặc trưng cho liên kết C=C của vòng thơm hoặc liên kết C=O trong các axit amin. Sự tồn tại của các liên kết này trên AgSa có thể chứng minh các hợp chất có trong dịch chiết quả Bồ hòn đã đóng vai trò là chất khử và chất ổn định trong quá trình tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh. Kết quả này là phù hợp với các công trình nghiên cứu đã công bố [88, 210].
Phương pháp phân tích nhiệt trọng (TGA) là kỹ thuật phân tích khối lượng của một chất theo sự thay đổi của nhiệt độ trong một chương trình xác định. Trong nghiên cứu này, phương pháp TGA được sử dụng để chứng minh sự tồn tại của các hợp chất hữu cơ trên bề mặt các hạt AgNPs và xác định hiệu suất phản ứng tổng hợp AgNPs. Kết quả phân tích nhiệt TGA/DTA của AgSa trong môi trường khí N2, với nhiệt độ
10 20 30 40 50 60 70 80 Int ensity (a. u.) 2-Theta (degrees) (111) (200) (220) (311) (a) (b) Int ensity ( a.u) AgNPs SME 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumber (cm-1) AgSa Sa 3416,10 2932,93 1721,81 1635,36 1253,74 1044,73 Cườ ng độ (a .u) Số sóng (cm-1) Cường độ (a.u)
80
25 - 800°C và tốc độ nâng nhiệt 5°C/phút trên Hình 3.5 cho thấy sự giảm khối lượng trước 150°C (7,86%) là do sự hóa hơi của nước, trong khoảng 150 - 550°C (43,78%) là do sự phân huỷ của các hợp chất hữu cơ còn dư và trên 550°C có thể là do sự bốc bay của nano bạc. Theo các tài liệu đã công bố AgNPs có nhiệt độ nóng chảy khoảng 200°C và bắt đầu bốc bay ở khoảng 600°C [76, 211]. Từ kết quả này cho thấy sự tồn tại của các chất hữu cơ trên bề mặt nano bạc sau quá trình tinh chế, chứng tỏ vai trò của chúng trong việc ổn định các hạt AgSa trong dung dịch phản ứng. Đường phân tích nhiệt vi sai (DTA) trên Hình 3.5 cho thấy có sự thay đổi khối lượng tại 550℃ tương ứng với giá trị TGA là 48,36%.
Do đó, hiệu suất quá trình tổng hợp AgSa được tính theo công thức (2.5) trình bày ở chương 2 thu được kết quả là 37,31% với các bước tính toán như sau:
𝐻 (%) = %𝐦𝐓𝐆× 𝐦𝐀𝐠𝐍𝐏𝐬
𝐦𝐀𝐠 × 100
Trong đó: %mTG = 48,36%
mAgNPs = ms - mt = 5,5109 – 5,5084 = 0,0025g = 2,5 mg Lượng nano bạc tinh khiết:
mAgNPs tinh khiết = 2,5*48,36% = 1,209 mg (/11ml) Lượng bạc tổng hợp ban đầu là:
mAg = nAg × MAg = CM × V × MAg = 3,24 (mg)
Hình 3.5: Kết quả phân tích nhiệt TGA/DTA của AgSa.
3.1.1.3. Khả năng kháng khuẩn của AgSa
Hoạt tính kháng khuẩn của AgSa ở các nồng độ (60, 30 và 15 g/ml) được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm (P. aeruginosa) và gram dương (S. aureus). Hoạt tính kháng khuẩn của AgSa được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thông qua đường kính kháng khuẩn trên đĩa petri được thể hiện trên Hình 3.6.
100 200 300 400 500 600 700 800 40 50 60 70 80 90 100 DTA TG ( %) Temperature (0C) TG 0 1 2 3 4 DT A (uV/m g) 589.5 C -7.86% -43.78% (c) Nhiệt độ (℃) H (%) = 48,36% × 1,209 3,24 × 100 = 37,31 (%)
81
Hình 3.6: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của AgSa.
(a) S. aureus, (b) P. aeuginosa và (c) đường kính kháng khuẩn đối với 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm ( SD, n = 3) (H2O: kiểm chứng âm; Strep: kiểm chứng dương (Streptomycin 30 g/ml); AgSapo (AgSa 60 g/ml); AgSapo-1/2 (AgSa 30 g/mL)
và AgSapo-1/4 (AgSa 15 g/ml)
Trên Hình 3.6a, b cho thấy với kiểm chứng âm là nước cất không xuất hiện vùng ức chế, trong khi kiểm chứng dương là Strep và mẫu AgSa đều có vùng ức chế với cả hai chủng thử nghiệm. Hơn nữa, hiệu quả kháng khuẩn tỷ lệ thuận với nồng độ nano bạc và phụ thuộc vào chủng vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả đo vùng ức chế vi khuẩn ở các nồng độ AgSa (Hình 3.6c) cho thấy vùng ức chế rộng nhất ở nồng độ AgSa cao nhất với chủng P. aeruginosa và S. aureus lần lượt là 12,0 ± 0,49 mm và 27,3 ± 0,28 mm. Kết quả này cho thấy AgSa có hiệu quả kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn gram dương tốt hơn gram âm. Một số nghiên cứu đã công bố về khả năng kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp xanh cũng cho kết luận tương tự [212, 213]. Mặc dù cơ chế diệt khuẩn của AgNPs đang còn nhiều tranh cãi nhưng hầu hết các nghiên cứu đều đề xuất cơ chế diệt khuẩn là sự bám dính của AgNPs vào thành tế bào vi khuẩn, xâm nhập vào bên trong tế bào, giải phóng ion bạc gây độc cho tế bào dẫn đến cái chết của vi khuẩn [47, 214].