9. Kết cấu của luận án
1.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng khuẩn
Để đánh giá khả năng kháng khuẩn của hợp chất chiết xuất, các thuốc tinh khiết được sử dụng làm chất kháng khuẩn có rất nhiều phương pháp trong đó phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng hoặc nuôi cấy trên đĩa thạch.
1.4.1.1. Phương pháp khuếch tán
a. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được phát triển vào năm 1940, là phương pháp được sử dụng để kiểm tra độ nhạy của chất kháng khuẩn. Hiện nay, phương pháp này đã chấp nhận và thực hiện theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute) [178].
Phương pháp này được thực hiện: các đĩa thạch được cấy với các chủng vi khuẩn thử nghiệm theo tiêu chuẩn. Sau đó, mẫu giấy lọc có đường kính khoảng 6 mm chứa hợp chất thử nghiệm ở nồng độ yêu cầu được đặt trên bề mặt đĩa thạch. Các đĩa petri được nuôi trong các điều kiện thích hợp. Chất kháng khuẩn khuếch tán vào thạch và ức chế sự sinh sản và phát triển của vi sinh vật thử nghiệm. Đánh giá kết quả bằng cách đo đường kính kháng khuẩn trên đĩa thạch. Hình 1.39 minh họa phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch [179]. Theo hướng dẫn của CLSI, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi và mật độ vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch được thể hiện trong Bảng 1.8. Phương pháp
43
này có nhiều ưu điểm như đơn giản, chi phí thấp, khả năng kiểm tra số lượng vi sinh vật và chất kháng khuẩn rất lớn, kết quả trực quan.
Bảng 1.8: Điều kiện thử nghiệm kháng khuẩn theo CLSI [178]
Phương pháp Vi sinh vật Môi trường Mật độ VK (CFU/mL) Nhiệt độ nuôi (℃) Thời gian nuôi (giờ) Khuếch tán đĩa thạch Vi khuẩn Mueller Hinton Agar (1 - 2) 108 35 2 16 - 18
Hình 1.39: Minh hoạ phương pháp khuếch tán đĩa thạch [179].
Nhược điểm của phương pháp này là không phân biệt tác nhân dệt khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, không thích hợp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), không thể định lượng lượng chất kháng khuẩn được khuếch tán vào môi trường thạch. Từ những ưu điểm, nhược điểm của phương pháp này nên phương pháp này sử dụng phổ biến để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất chiết xuất từ thực vật, tinh dầu và các loại thuốc khác.
b. Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của thực vật hoặc chất kháng khuẩn khuếch tán khác [178, 180]. Tương tự như quy trình được sử dụng trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch, bề mặt đĩa thạch được cấy bằng cách trang một lượng vi sinh vật lên toàn bộ bề mặt thạch. Sau đó, các giếng có đường kính từ 6 đến 8 mm được đục bằng một dụng cụ vô trùng và một thể tích (20 - 100 µl) chất kháng khuẩn được đưa vào giếng. Các đĩa thạch sau đó được nuôi trong các điều kiện thích hợp tùy thuộc vào vi sinh vật thử nghiệm. Chất kháng khuẩn khuếch tán trong môi trường thạch và ức chế sự phát triển của chủng vi sinh vật thử nghiệm. Hình 1.40 hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc với một số chủng vi khuẩn thử nghiệm theo phương pháp khuếch tán giếng thạch. Ngoài ra, trong nhóm phương pháp khuếch tán đĩa thạch còn các phương pháp khác như phương pháp Etest, phương pháp khuếch đặt thạch (Agar plug diffusion method), phương pháp vạch kẻ (Cross streak method) [178].
44
1.4.1.2. Phương pháp pha loãng
Phương pháp pha loãng là phương pháp thích hợp nhất để xác định các nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum Inhibitory Concentration), vì phương pháp này ước tính được nồng độ của chất kháng khuẩn được thử nghiệm trong thạch (pha loãng thạch) hoặc pha loãng canh trường (canh thang) [178, 180]. Đây là phương pháp định lượng để xác định hiệu quả kháng khuẩn cũng như kháng nấm. Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn được thử nghiệm ức chế sự phát triển của vi sinh vật được thử nghiệm và nó thường được biểu thị bằng g/mL hoặc mg/L. Thử nghiệm phương pháp này theo các tiêu chuẩn tham chiếu được thiết lập bởi các cơ quan khác nhau như CLSI, EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing: Ủy ban Châu Âu về thử nghiệm tính nhạy với kháng sinh), BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy: Hội Hóa liệu kháng sinh Anh quốc), AFFSAPS (The French Agency for the Safety of Health Products: Cơ quan Quản lý Dược phẩm Pháp) và DIN (German Institute For Standardization: Viện Tiêu chuẩn Đức) [27].
a. Pha loãng canh trường
Phương pháp pha loãng canh trường thường được thực hiện trong ống nghiệm hay trong khay vi phiến (96 giếng) [181]. Chất kháng khuẩn thường được pha loãng theo gấp đôi nối tiếp trong môi trường lỏng chứa vi khuẩn. Sau khi nuôi ở điều kiện quy định (35 2℃, 18 giờ) thì đo độ đục hoặc quan sát bằng mắt thường để xác định nồng độ ức chế tối thiểu. Hình 1.41 minh họa các bước thực hiện để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo CLSI thực hiện theo kỹ thuật vi phiến (96 giếng).
Hình 1.41: Quy trình thử nghiệm kháng khuẩn theo tiêu chuẩn CLSI [181].
b. Pha loãng trong môi trường thạch
Phương pháp pha loãng thạch liên quan đến việc kết hợp các nồng độ của chất kháng khuẩn vào môi trường thạch (môi trường thạch nóng), thường sử dụng dãy pha loãng gấp đôi nối tiếp, tiếp theo là cấy vi sinh vật đã xác định lên bề mặt đĩa thạch. Giá trị MIC được ghi nhận là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển trong điều kiện nuôi thích hợp. Kỹ thuật này phù hợp để kiểm tra kháng khuẩn và kháng nấm [178, 180]. Ngoài ra còn một số phương pháp khác để đánh giá khả năng kháng khuẩn của chất kháng khuẩn như phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC: Thin-layer chromatography), phương pháp tiếp xúc động để xác định khả năng
45
kháng khuẩn phụ thuộc vào thời gian và nồng độ chất kháng khuẩn, phương pháp định lượng ATP bằng phát quang sinh học… [181]
Tóm lại, có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn như phương pháp khuếch tán, phương pháp pha loãng hoặc nuôi cấy trên đĩa thạch... Các kỹ thuật thực hiện đã được tiêu chuẩn hóa bởi CLSI và EUCAST, BSAC, AFFSAPS, DIN, ISC. Tuy nhiên, tùy thuộc vào chất kháng khuẩn, mục đích xác định, loại vi sinh vật cần thử nghiệm để lựa chọn phương pháp phù hợp. Khi thử nghiệm các sản phẩm từ tự nhiên hoặc có đặc điểm khác biệt thì có thể điều chỉnh nhỏ các quy trình chuẩn hóa nhưng vẫn đảm bảo thử nghiệm chính xác.