Cho dù NLSH thế hệ 1 đem lại lợi ích, nhưng nó có những hạn chế đáng kể và mức độ chấp nhận thấp trên các vùng đất không ổn định do vẫn chưa ngã ngũ xung quanh vấn đề sản xuất và sử dụng. Khi thời hoàng kim của loại nhiên liệu này mất đi, người ta đã tìm đến NLSH thế hệ 2. Loại nhiên liệu thế hệ này được sản xuất từ các nguyên liệu đầu vào không phải là lương thực và sử dụng các công nghệ sản xuất NLSH thế hệ 1 được cải tiến.
Nhiều người hy vọng rằng, NLSH thế hệ 2 sẽ giải quyết các vấn đề chưa ngã ngũ xung quanh sản xuất NLSH và có thể cung cấp một khối lượng lớn nhiên liệu bằng phương pháp thích hợp có thể chấp nhận được và với những lợi ích lớn hơn về môi trường.
NLSH thế hệ 2 chủ yếu là ethanol xeluloza được sản xuất từ ligno xenluloza có trong sinh khối gỗ, cỏ và các thành phần thực vật không ăn được. Các công nghệ được sử dụng có thể phân hủy được nhiều đường tổng hợp mà không phải sử dụng các phương pháp lên men. Việc chuyển đổi các nguồn sinh khối xenluloza và bán xenluloza thành ethanol đang mở ra một triển vọng mới trong cung cấp nhiên liệu, khi sinh khối từ chất thải đã có sẵn với khối lượng lớn và có khả năng tái tạo.
NLSH thế hệ 2 và các công nghệ khác nữa đang được nghiên cứu phát triển đó là:
- Hyđrô sinh học. Hyđrô sinh học cũng giống như hyđrô, trừ khi nó được sản xuất từ các nhiên liệu đầu vào là sinh khối. Sản xuất hyđrô sinh học sử dụng phương pháp khí hóa sinh khối và loại bỏ mêtan được tạo ra. Phương pháp lựa chọn này có thể thực hiện đối với một số loài sinh vật có thể trực tiếp tạo ra hyđrô trong các điều kiện nhất định. Hyđrô sinh học có thể được sử dụng trong pin nhiên liệu để tạo ra điện năng.