4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium
Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí. Chi Agrobacterium gồm 4 loài, trong đó A. tumerfaciens có khả năng tạo ra khối u trong
tế bào thực vật thông qua một loại plasmid đặc hiệu gây nên khối u gọi là Ti- plasmid (tumour inducing) [3,2]. Ti-plasmid có khả năng chuyển một số gene chúng mang vào cây trồng khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật nó sẽ tấn công vào hệ thống tế bào của thực vật một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn đây được coi là hiện tượng chuyển gene tự nhiên. Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết
cho quá trình chuyển gene:
- Vùng T-ADN: là đoạn ADN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gene của cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gene có thể biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [22].
- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gene vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gene. Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp của T-ADN. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gene [22].
- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T- ADN, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt genes) … Ngoài ra những gene khác như mia A đóng vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [22].
Cơ chế chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens: Quá
trình chuyển T-ADN được bắt đầu ở vị trí biên phải và kết thúc ở vị trí biên trái. Nếu không có sự định hướng này, hiệu quả của quá tình chuyển gene sẽ rất thấp [8]. Đoạn T-ADN mang gene muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt động của các gene vir. Hiện tượng này xảy ra khi A. tumerfaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy. Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid, đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5), phosphat và opine, làm dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống như những sản phẩmcủa chuyển hoá phenyl propanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và các chất thơm. Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện stress và bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các gene vùng vir. Sự thể hiện gene vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản phẩm của virA và virG. Chính các sản phẩm protein của các gene vir đã làm nhiệm vụ vận chuyển T-ADN. Một số bằng chứng chứng tỏ T-ADN được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào geneome thực vật, sau đó, T-ADN được phiên mã nhờ ARN polymerase II [18,16].
Quá trình chuyển T-ADN cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:
• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực vật do xâm nhập và hợp nhất của T-ADN vào tế bào thực vật, sau đó biểu hiện các gene trong vùng T-ADN.
• Sự kiện thứ hai: Các gene nằm trong vùng T-ADN sao chép trong các tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển.
• Sự kiện thứ ba: Vùng ADN lạ đặt giữa các vùng biên của T-ADN có thể được chuyển cho tế bào cây trồng.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU