4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.5.4. Phương pháp chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana
2.5.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ
sung các kháng sinh chọn lọc rifamicin 100mg/l, spectinomycin 100mg/l đối với chủng A.tumerfacien mang vector chuyển gen chứa cấu trúc pER8-CBF1; nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ.
-Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 10ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc như khi nuôi ở môi trường LB đặc. Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC nuôi qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 28oC. Dịch khuẩn thu được có OD260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp.
Hình 2.1. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen
Gieo và chăn sóc trong điều kiện ngày ngắn đến khi ra hoa
Hút chân không trong 30 giây
Ly tâm thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch đồng nuôi cấy Hạt A. thaliana đã
được xử lý này mầm
Cây A. thaliana nở hoa
A. tumefaciens được
nuôi trong môi trường LB 48 giờ Dung dịch đồng nuôi cấy + vi khuẩn A. tumefaciens Hạt A. thaliana chuyển gen + Nhúng hoa trong 30 giây Trồng, chăm sóc trong nhà lưới tới khi có quả
Cây A. thaliana được trồng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ sáng/ 16 giờ tối) tới khi cây ra hoa. Sau đó, tiến hành chuyển gen vào hoa theo phương pháp nhúng hoa [16]. Hoa được ngâm trong dụng dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM, sucrose 5%) có OD = 0,8 trong 30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt trong bình kín 3 ngày. Cứ 6 ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín tiến hành thu hạt và xử lý này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo.
2.5.4.3. Phương pháp chọn lọc và phân tích cây chuyển gen
Sau khi có được hạt cây A. thaliana chuyển gen đem gieo trên môi trường MS/10 có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l, theo dõi số cây sống, số cây chết. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen AtYUCCA6 bằng PCR.
Những cây A. thaliana sống sót trên môi trường chọn lọc được chuyển ra bầu
đất, chăm sóc đến khi ra hoa, tiến hành thu mẫu lá, tách ADN. DNA tổng số được thu nhận theo phương pháp CTAB theo quy trình các bước như sau:
- Bước 1: chuẩn bị mẫu:
Mẫu lá khử trùng bằng cồn 70o (dùng bông gòn thấm cồn và lau đều trên cả hai bề mặt lá) , dùng kéo cắt lấy phần thịt lá ở hai bên và bỏ phần gân lá ở giữa. Phần thịt lá được gói trong giấy nhôm và ngâm nitơ lỏng trong thời gian 10 phút. Sau đó, nghiền kỉ mẫu bằng cối và chày đã được khử trùng bằng cách ngâm nitơ lỏng.
- Bước 2: phá vỡ màng tế bào và màng nhân: nghiền 2,2, ml bột mịn với 1 ml dịch trích EB (extraction buffer). Tiếp tục cho 50ml dung dịch SDS 10% vào túp, sau đó lắc nhẹ túp.
- Bước 3: ủ mẫu ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, trong quá trình ủ khoảng 5 phút đảo nhẹ túp để trộn mẫu.
- Bước 4: li tâm mẫu với vận tốc 13000rpm trong 10 phút
- Bước 5: tủa DNA bằng cách hút 800ml phần dung dịch trong ở phía trên cho vào túp mới, sau đó cho 800ml dung dịch isopropanol vào tiến hành ủ trong khoảng
- Bước 6: hòa tan tủa: li tâm xong, phần dịch trong được bỏ vào một cái hộp mũ có chứa nước và thu phần kết tủa. Hòa tan tủa DNA trong 400ml TE,
- Bước 7: tạo phức với CTAB: Cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 15 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều.
- Bước 8: bỏ protein và các phức hợp: cho thêm vào túp 800ml
Chloroform/Isoamylalcohol lắc đều và li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút.
-Bước 9: tủa DNA: Sau khi ly tâm ta tiến hành hút 500ml phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, thêm vào túp này 1ml Ethanol 96% ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút. Ethanol 96% được sử dụng kết hợp với muối để tránh gây hại cho DNA.
- Bước 10: rửa DNA: Li tâm xong đổ bỏ phần dịch trong ở phía trên vào hộp mũ có chứa nước, thu lấy phần kết tủa ở phía dưới. Sau đó, tiến hành rửa kết tủa với ethanol 70% để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Phần kết tủa được rửa 2 lần với ethanol 70% (không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp). Mỗi lần rửa cho 400ml ethanol 70% vào túp, lắc nhẹ và đem li tâm trong 5 phút với vận tốc 13000rpm, sau đó loại bỏ ethanol.
- Bước 11: phơi khô DNA: Tiến hành phơi khô DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Bước 12: hòa tan DNA: DNA sau khi phơi khô, được hòa tan trong 50ml nước. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch DNA trên: hút 90ml nước cho vào một túp 1,5ml mới, sau đó hút 10ml dung dịch DNA cho vào túp chứa 90ml nước, lắc nhẹ. Túp 1,5ml này được đem đi đo OD. Dung dịch DNA còn lại trong túp 2,2ml là 40ml được dùng để chạy điện di.
DNA tổng số thu được được sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen AtYUCCA6.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN