4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.4. Tạo cây Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6
Sau khi tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gen pER8-pUBQ14:
AtYUCCA6, để kiểm tra khả năng biểu hiện của gen AtYUCCA6 sau khi được gắn
với promoter tăng cường , chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên cây mô hình
Arabidopsis thaliana. Cấu trúc vector chuyển gen pER8-pUBQ14: AtYUCCA6
được chuyển vào cây Arabidopsis thaliana thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp nhúng cụm hoa [16]. Hoa được ngâm trong dụng
dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM, sucrose 5%) có OD = 0,8 trong 30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt trong bình kín 3 ngày. Cứ 6 ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín tiến hành thu hạt và xử lý này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo. Hạt của cây chuyển gen T0 được chọn lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin nồng độ 50mg/l. Sau 7 ngày chúng tôi thống kê tỷ lệ cây sống ở bảng 3.2: 1,25 (A) (B) (C) 1,25 2,25 11,9 kb
Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen AtYUCCA6 trên môi trường kháng sinh kanamycin Cây chuyển gen To Số hạt chọn lọc (hạt)
Cây T1 chuyển gen trên môi trường kanamycin 50mg/l sau 7 ngày Số cây chết (cây) Số cây sống (cây) Tỷ lệ chọn lọc (%) 1 500 414 86 17,2 2 500 398 102 20,4 3 500 404 96 19,2
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy trong tổng số 1500 hạt được chọn lọc với 3 lần thí nghiệm, có 284 cây sống, hiệu quả chuyển gen dựa trên gene kháng kháng sinh kanamycin đạt 18,9% . Điều đó chứng tỏ bước đầu chuyển gen đã thành công.
Để đánh giá cây chuyển gen, chúng tôi chuyển 50 cây chuyển gen kháng kanamycin ra trồng và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR. Kĩ thuật PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo lí thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen cần chuyển.
Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 15 cây chuyển gen với cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R cho thấy 13/15 cây cho bằng vạch có kích thước khoảng 1,25kb tương ứng với kích thước của gen AtYUCCA6 chuyển vào. 2/15 cây không xuất hiện băng vạch có kích thước tương ứng với gen AtYUCCA6 (hình 3.9).
Hình 3.9. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR sử dụng cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R.
Ghi chú:
M: thang chuẩn 1kb;
(+) đối chứng dương: plasmid pER8-AtYUCCA6 (-) đối chứng âm: plasmid của cây không chuyển gen Từ 1 đến 15 là thứ tự cây chuyển gen AtYUCCA6.
Theo kết qủa trên hình 3.9 trong 15 mẫu Arabidopsis thaliana chuyển gen có 13 mẫu cho kết quả dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
AtYUCCA6-F và pER8-R ( các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15), thu được
sản phẩm có kích thước 1,25 kb tương ứng với kích thước gen AtYUCCA6 theo lý thuyết. Bước đầu chứng tỏ các mẫu này đã mang gen AtYUCCA6.
Trong 15 mẫu có 2 mẫu cho kết quả âm tính với PCR ( mẫu 9, 10 ). Đối chứng dương là plasmid pER8-AtYUCCA6 làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu là plasmid tách chiết từ lá Arabidopsis thaliana không chuyển gen, đều cho kết quả âm tính. Như vậy, kết quả dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtYUCCA6-F và pER8-R của 15 cây Arabidopsis thaliana đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây Arabidopsis thaliana có mang
cấu trúc gen cần chuyển.
Một số nghiên cứu trước đây đã tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gene AtYUCCA6 cho kết quả rất khả quan. Kim và cộng sự (2013) tạo cây khoai tây chuyển gene siêu biểu hiện AtYUCCA6 dưới sự điều khiển của promoter
M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
+ + + + + + + + - - + + + + +
PT cho khả năng chịu hạn cao hơn cây đối chứng khoảng 12 ngày [30]. Tương tự Ke và cộng sự (2015) [31] đã sử dụng vector pCAMBIA2300 mang promoter cảm ứng SWPA2 để tạo cây hướng dương chuyển gen AtYUCCA6. Kết quả cho thấy cây
chuyển gene sinh trưởng nhanh hơn và chống chịu với điều kiện hạn hơn cây đối chứng khoảng 6 ngày. Park và cộng sự (2019) [38] tạo cây đậu tương chuyển gen
AtYUCCA6 sử dụng cấu trúc vector pPZP-p35S: AtYUCCA6 cho thấy cây chuyển
gen có khả năng chịu hạn sau 14 ngày thiếu nước. Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy gene AtYUCCA6 có khả năng ứng dụng cao để tạo cây chuyển gene chịu hạn. Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế vector sử dụng promoter cơ định Ubiqutin 14 ( UBQ14) điều khiển gene AtYUCCA6 nhằm ứng dụng tạo cây chuyển gene chịu hạn ở Việt Nam. Promoter Ubiquitin có vai trò tương tự như promoter 35S hiện được nhiều nhà khoa học sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Dựa trên cơ sở dữ liệu database, gen AtYUCCA6 được lựa chọn nghiên cứu có kích thước 3719bp, vùng gen mã hóa có chiều dài 1,25kb biểu hiện mạnh ở cơ quan sinh sản (hoa, hạt phấn) của cây.
Gen AtYUCCA6 được tách dòng thành công bằng vector tách dòng pBluescript. Kết quả tách dòng được kiểm tra bằng giải trình tự gen đảm bảo độ chính xác 100%. Vector chuyển gene pER8::pUBQ14-AtYUCCA6 đã được thiết kế thành công với promoter UBQ14 và gen chọn lọc kanamycin.
Cấu trúc chuyển gen pER8:pUBQ14-AtYUCCA6 được chuyển thành công vào cây Arabidopsis thaliana. Tỷ lệ cây chuyển gen trên môi trường kháng kanamycin đạt 18,9%.
2. Kiến nghị
Cần triển khai tiếp các thí nghiệm chuyên gen pUBQ14-AtYUCCA6 trên cây mô hình và đánh giá khả năng biểu hiện của gen được chuyển AtYUCCA6 dưới sư
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, Nxb Khoa học và Công nghệ.
2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với
thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM.
3. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene ở thực
vật, Giáo trình cho Cao học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
4. Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh lý thực vật, Nxb Giáo Dục, Hà Nội.
5. Trần Thị Phương Liên (1998), “Cơ chế phân tử tính chịu hạn của thực vật”, Tạp chí Khoa học và Phát triển.
6. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng
dụng công nghệ gene trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Ong Xuân Phong, Nguyễn Văn Mã (2014), Một số biến đổi sinh lý ở hạt nảy
mầm và cây non đậu tương trong điều kiện nhiệt độ thấp, Tạp chí Khoa học và Phát
triển, số 7: 1114-1119.
8. Hoàng Minh Tấn (2006), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Đại học Sư Phạm. 9. Trần Văn Tựa, Nguyễn Trung Kiên, Đỗ Tuấn Anh, Đặng Đình Kim (2011).
Nghiên cứu khả năng chống chịu và hấp thu chì, kẽm của Dương xỉ Ptreris vittataL.
Tạp chí khoa học và công nghệ. 101 - 109.
10. Lê Duy Thành (2001). Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
11. Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997).
GeneGenGenes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup- shaped cotyledon mutant. Plant Cell 9: 841-857.
13. Bhargava, S. and Sawant K.(2013). Drought stress adaptation: metabolic
adjustment and regulation of genegengene expression. Plant Breeding, 132 (1), pp.
21-32.
14. Blum, A.(2005). Drought resistance, water-use efficiency, and yield potential—are they c ompatible, dissonant, or mutually exclusive, Crop and Pasture
Science, 56 (11), pp. 1159-1168.
15. Collins W. K; Hawks S. N.Jr, (1993). Principles of hte Flue - cured Tobaco Production. N.C. State Univesity 2nd Ed. 300.
16. Cha, J.-Y. et al. (2015).A novel thiol-reductase activity of Arabidopsis ATYUCCA6 confers drought tolerance independently of auxin biosynthesis.nature Commun. 6: 8041 doi: 10.1038 / ncomms9041
17. Chaves, M., Flexas J., and Pinheiro C. (2009). Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell, Annals of
botany, 103 (4), pp. 551-560.
18. Davis D. L.; Nielsen M. T. (1999).Tobaco Production, Chemistry and
technology. B Blackwell Science . 467.
19. Ding Z. S., Zhao M., Jing Y. X., Li L. B. and Kuang T. Y. (2006). “EfficientAgrobacterium, Mediated transformation of Rice by Phosphomannose
Isomerase/Mannose selection”,Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.29)5-303.
20. Ditt R. F., Nester E. W. and Comai L. (2005). The plant cell defense andAgrobacterium tumefaciens.FEMS Microbiology letters, 247, pp. 207-213.
21. Feng, J.-X., Liu D., et al. (2005).An annotation update via cDNA sequence
analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor genegengene family, Plant molecular biology, 59 (6), pp. 853-868.
22. Gelvin S. B. (2003).“Agrobacterium - mediated plant transformation the
biology behind the “GeneGenGene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular
23. Guo, H. and Ecker J.R. (2004). The ethylene signaling pathway: new insights, Current opinion in plant biology, 7 (1), pp. 40-49.
24. Hao, D., Ohme-Takagi M., and Sarai A.(1998). Unique mode of GCC box
recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive elementbinding factor (ERF domain) in plant, Journal of Biological Chemistry, 273 (41), pp. 26857-
26861.
25. Harb, A., Krishnan A., Ambavaram M.M., and Pereira A. (2010). Molecular
and physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early responses
leading. Plant Physiol, pp 1254 - 1271.
26. Hayano-Kanashiro, C., Calderón-Vázquez C., Ibarra-Laclette E., HerreraEstrella L., and Simpson J.(2009). Analysis of genegengene expression and physiological responses in three Mexican maize landraces under drought stress and recovery irrigation,
PLoS One, 4 (10), pp. e7531
27. Jeong Im Kim , ( 2011) YUCCA6 over-expression demonstrates auxin function in delaying leaf senescence in Arabidopsis thaliana. J Exp Bot 21/4/2011
28. K. S. Mysore, R. P. Tuori, and G.B, Martin (2001).Arabidopsis gengeneome
sequence as a tool for functional gengeneomics in tomato, GenGeneome Biol 2. 1086
- 1186.
29. Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM(1984). Taproot elongation rates of
Soybean cultivars in the glasshouse and their relatio to field rooting depth. Crop Sci
24: 916 - 920.
30. Kepinski S và Leyser O. (2005) The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an
auxin receptor. Nature 435: 446-451
31. Kim, J.I, Baek, D, Park, H.C, Chun, H.J, Oh, D.H, Lee, M.K, Cha, J.Y, Kim, W.Y, Kim, M.C, Chung, W.S, Bohnert, H.J, Lee, S.Y, Bressan, R.A, Lee, S.W, Yun, D.J. (2013) Overexpression of Arabidopsis YUCCA6 in potato results in
high-auxin developmental phenotypes and enhanced resistance to water deficit. Mol
32. Kim, J.I., Sharkhuu, A., Jin, J.B., Li, P., Jeong, J.C., Baek, D., Lee, S.Y., Blakeslee, J.J., Murphy, A.S., Bohnert, H.J., et al. (2007). yucca6, a dominant mutation in Arabidopsis, affects auxin accumulation and auxin-related phenotypes.
Plant Physiol. 145, 722-735.
33. Le, M.Q., Pagter M., and Hincha D.K (2015). Global changes in genegengene expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RT- PCR, during acclimation of three Arabidopsis thaliana accessions to sub-zero temperatures after cold acclimation, Plant molecular biology, 87 (1-2), pp. 1-
34. Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M. (2011).
Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in Arabidopsis. Planta. 235, 923-938.
35. Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M. (2011).
Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in Arabidopsis. Planta. 235, 923-938.
36. Mashiguchia, K., Tanaka, K., Sakaic, T., Sugawaraa, S., Kawaideb, H., Natsumeb, M., Hanadaa, A., Yaenoa, T., Shirasua, K., Yaod, H., et al. (2011). The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis. Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 108,
18512-18517.
37. Paponov, I.A, Teale, W.D, Trebar, M., Blilou I., Palme, K. (2005) The PIN
auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives. Trends Plant Sci
10: 170-177
38. Park, J.S, Kim, H.J, Cho, H.S, Jung, H.W, Cha, J.Y, Yun, D.J, Oh, S.W, Chung, Y.S. (2019) Overexpression of AtYUCCA6 in soybean crop results in
reduced ROS production and increased drought tolerance. Plant Biotech Rep (13),
161-168
39. Ross, J.J., Tivendale, N.D., Reid, J.B., Davies, N.W., Molesworth, P.P., Lowe, E.K., Smith, J.A., and Davidson, S.E. (2011). Reassessing the role of YUCCAs
40. Van der Graaff, E., Boot, K., Granbom, R., Sandberg, G., and Hooykaas, P.J.J. (2003). Increased endogenous auxin production in Arabidopsis thaliana causes
both earlier described and novel auxin-related phenotypes. J. Plant Growth Regul.
22, 240-252.
41. Won, C., Shen, X., Mashiguchi, K., Zheng, Z., Dai, X., Cheng, Y., Kasahara, H., Kamiya, Y., Chory, J., and Zhao, Y. (2011). Conversion of tryptophan
to indole-e-acetic acid by Tryptophan aminotransferases of Arabidopsis and YUCCAs in Arabidopsis. Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 108, 18518-18523.
42. Woo, Y., Park, H., Su’udi, M., Yang, J., Park, J., Back, K., Park, Y., and An, G. (2007). Constitutively wilted 1, a member of the rice YUCCA gene family, is
required for maintaining water homeostasis and an appropriate root to shoot ratio. Plant Mol. Biol. 65, 125-136.
43. Yunde zhao (2014), Auxin biosynthesis, Arabidopsis book.
44. Zhao, Y. (2012). Auxin biosynthesis: a simple two-step pathway converts tryptophan to indole-3-acetic acid in plants. Mol.Plant. 5, 334-338.
45. Zhao, Y., Christensen, S.K., Fankhauser, C., Cashman, J.R., Cohen, J.D., Weigel, D., and Chory, J. (2001). A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis. Science. 291,306-309.