4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Phân tích gene AtYUCCA6 trên cơ sở dữ liệu database
Gene AtYUCCA6 mã hóa cho protein nhóm flavin monooxygenases có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp auxin. Gene AtYUCCA6 nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (hình 3.1), kích thước 3719 bp, vùng mã hóa 1,25kb, có 5 exon và 4 intron mã hóa cho 434 amino axit (TAIR, https://seqviewer.arabidopsis.org, hình 3.2). Gene biểu hiện ở tất cả các bộ phận của cây. Trong đó mạnh nhất ở cơ quan sinh sản như cụm hoa, hạt phấn (hình 3.3).
Hình 3.1. Vị trí của gene AtYUCCA6 (At5g25620) trên nhiễm sắc thể số 5 (Wease et al. 2017)
Hình 3.3. Biểu hiện của gene AtYUCCA6 ở cây Arabidopsis thaliana
3.2. Tách dòng gene AtYUCCA6
Dựa trên kết quả phân tích chúng tôi tiến hành tách dòng gene AtYUCCA6 để
ứng dụng cho chuyển gene. Từ nụ hoa của cây Arbidopsis thaliana, tiến hành tách mRNA tổng số, nồng độ mRNA được đo bằng phương pháp đo OD 260/280 nm. 1 μg mRNA được sử dụng làm khuôn tạo cDNA. cDNA sau khi được tổng hợp tiếp tục được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân gen AtYUCCA6. Bằng phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) với cặp mồi đặc hiệu AtYUCCA6NotI-F và AtYUCCA6SepI-R toàn bộ chiều dài 1,25kb trình tự gene mã hóa (coding sequences-CDS, hình 3.4 ) được khuếch đại trên khuôn cDNA.
Hình 3.4. Trình tự vùng mã hóa của gen AtYUCCA6 và trình tự protein tương ứng
Ghi chú: Trình tự in đậm gạch chân biểu thị vị trí mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong nghiên cứu
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít của hãng Solgenet (http://www.solgenet.com) để sử dụng cho tách dòng gene. Sử dụng vector tách dòng pBluescript (pBS) mang promoter UBQ14 đã được chèn sẵn vào vị trí giữa AscI và
NotI. Gene AtYUCCA6 được đưa vào vị trí giữa hai enzyme NotI và SpeI sau khi được
cắt và nối bằng enzyme T4 DNA ligase (Hình 3.5A). Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn Ecoli DH5α bằng phương pháp biến nạp ( 42°C, 30 giây), nuôi trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampiciclin với nồng độ 100mg/ l. Sau khoảng 16h nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, chúng tôi kiểm tra ngẫu nhiên 16 khuẩn lạc bằng kỹ thuật PCR tại chỗ với cặp mồi AtYUCCA6NotI-F và M13. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy tất cả đều dương tính với băng vạch có kích thước khoảng 1,25kb tương ứng với kích thước của đoạn gene
AtYUCCA6 (Hình 3.6A). Trong đó khuẩn lạc số 8 và 13 cho 1 băng duy nhất rõ nét
tương ứng với kích thước của gen. Khuẩn lạc số 3, 4 và 10 cho băng rất mờ, các khuẩn lạc còn lại xuất hiện băng phụ có kích thước lớn hơn kích thước của gen do
kiểm tra chính xác, chúng tôi nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 8 và số 13, tách DNA plasmid và cắt bằng enzyme giới hạn NotI và SpeI. Kết quả điện di cho thấy trên bản gel có hai phân đoạn DNA với kích thước khoảng 4 kb và 1,25kb. Trong đó kích thước của vector tách dòng pBS mang promoter UBQ14 là 4 kb và gene AtYUCCA6 là 1,25 kb (Hình 3.6 B).
Để kiểm tra cấu trúc gen AtYUCCA6, chúng tôi tiến hành giải trình tự gene và so sánh trình tự gen nhận được với trình tự genne gốc trên ngân hàng NCBI bằng công cụ Blast. Kết quả giải trình tự gene với cặp mồi M13 (-40) cho thấy gene AtYUCCA6 có độ tương đồng 100% với trình tự gốc và trình tự amino axit được bảo
toàn. Hình 3.7 thể hiện một phần kết quả tách dòng gene AtYUCCA6 được kiểm tra bằng công cụ Blast trên ngân hàng gene (NCBI) với mồi ngược M13 (-40) cung cấp bởi công ty COSMOGENETECH. Trình tự gene AtYUCCA6 bắt đầu từ vị trí 381, xen giữa vị trí từ 375 đến 380 là trình tự enzyme SpeI (ACTAGT) nối giữa gene
Hình 3.5. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gene AtYUCCA6.
(A)-vector nhân dòng pBluescipt được cắt mở vòng và chèn đoạn gene pUBQ14-
AtYUCCA6 tại vị trí enzyme cắt giới hạn AscI và SpeI trong vùng MCS.
(B)-vector chuyển gene pER8 được chèn cấu trúc pUBQ14-AtYUCCA6 có gene chỉ thị chọn lọc kanamycin trong vùng RB và LB.
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 bằng PCR và enzyme giới hạn.
(A)-PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi M13 và AtYUCCA6. Mũi tên chỉ đoạn khuếch đại kích thước khoảng 1,25kb tương ứng với kích thước mong muốn khi điện di trên gel agarose 1%.
Kết quả cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều dương tính với băng vạch 1,25 kb tương ứng với kích thước gen AtYUCCA6
(B)- Khuẩn lạc số 8 và 13 được kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn NotI và SpeI cho kích thước tương ứng với gene AtYUCCA6 và vector tách dòng pBS.
Kết quả cả hai khuẩn lạc 8 và 13 đều dương tính với băng vạch có kích thước 4 kb tương ứng với kích thước vector pBs và băng vạch 1,25 kb tương ứng kích thước gen
AtYUCCA6.
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi ngược M13 (-40)
spe I
1,25k 1,25k
(A) (B)
Trình tự nucleotid trong hộp màu đỏ là vị trí enzyme cắt SpeI nối giữa gene
AtYUCCA6 và vector pBluescript tương ứng.
Từ các kết quả thu được chúng tôi khẳng định gene AtYUCCA6 được tách dòng thành công, ký hiệu là pBS-UBQ14: AtYUCCA6.