4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.3. Gắn vào vector chuyển gene
Sau khi tách dòng thành công, gene AtYUCCA6 được đưa sang vector chuyển
gene pER8 kích thước 11,9kb có các vị trí enzyme cắt giới hạn AscI và SpeI. Cắt đồng
thời pBS::pUBQ14-AtYUCCA6 và pER8 vector với enzyme AscI và SpeI và ghép nối bằng enzyme T4 DNA ligase theo sơ đồ mô tả ở hình 3.5A và 3.5B. Phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và nuôi cấy trải trên đĩa thạch có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 8 khuẩn lạc bằng PCR sử dụng cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R cho thấy cả 8 khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với kích thước gene tương ứng khoảng 1,25kb (Hình 3.8A). Khuẩn lạc số 1, 3 và 6 được nuôi tăng sinh và kiểm tra bằng enzyme cắt AscI và SpeI. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid từ 3 khuẩn lạc trên đều thu được 2 băng có kích thước khoảng 11,9 kb và 2,25 kb tương ứng với kích thước của vector pER8 và cấu trúc pUBQ14-AtYUCCA6 (Hình 3.8B) chứng tỏ gene AtYUCCA6 được chèn thành công vào vector chuyển gene pER8. Ký hiệu lần lượt là pER8: pUBQ14-AtYUCCA6-1, 3 và 6. Để đánh giá khả năng biểu hiện gene trên cây cây mô hình Arabidopsis, chúng tôi tiến hành đưa vector chuyển pER8: pUBQ14-AtYUCCA6-1 vào chủng vi khuẩn GV3101. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc trên môi trường kháng sinh rifampicin, spectinomycin và genetamycin cho thấy hầu hết các khuẩn lạc đều dương tính với cặp mồi pER8-R cho kích thước gene khoảng 1,25kb tương ứng với gene AtYUCCA6 (Hình 3.8C). Từ các kết quả trên chứng tỏ gene AtYUCCA6 đã được gắn vào vector chuyển gene và biến nạp vào vi khuẩn sẵn sàng cho các thí nghiệm chuyển gene.
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6
(A)- Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R trong Ecoli (B)- Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn AscI và SpeI.
(C)- Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R trong Agrobacterium GV3101