4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.5.2. Tách dòng gene AtYUCCA6
2.5.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách từ nụ hoa cây Arabidopsis thaliana bằng bộ Kit Rneasy Plant Mini của hảng Quiagen. Các bước tiến hành như sau:
- Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng bằng máy nghiền bi 270 vòng/giây. - Thêm 1ml Trizon Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
- Thêm 200 µl C: I (24 clorofom :1 isoamyl), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 40C. Thu 500µl dịch nổi,cho vào ống eppendort loại 1,5 ml.
- Bổ sung 500 µl isopropanol 40C cho vào ống, đảo đều trong 15 phút ở 250C (Hoặc ủ qua đêm ở -200C).
- Bổ sung 700 µl cồn 70%, li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa, thực hiện hai lần.
- Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng khoảng 15 - 20 phút.
- Bổ sung 50 µl H2O khử ion có bổ sung DEPC 0,01% ủ ở nhiệt độ 550C trong 15 phút cho tan RNA. Voltex để RNA tan hoàn toàn.
Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy quang phổ kế Biorad Specphotometer ở bước sóng OD260/280.
2.5.2.2. Phương pháp tạo cDNA từ mRNA tổng số
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA STT Thành phần Thể tích 1 RNA tổng số 5 µl 2 Oligo DT 1 µl 3 DEPC Water 6 µl Tổng 12 µl
- Ủ ở 650C trong 5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh.
- Bổ sung: Reaction Buffer 4 µl; RibolockTM Rnase Trizone Regents 1µl; dNTP 2 µl; RTase 1µl.
- Đặt vào máy PCR theo chu trình nhiệt: 250C trong 15 phút; 420C trong 60 phút; 700C trong 5 phút.
2.5.2.3. Phương pháp nhân gen AtYUUCA6 bằng kỹ thuật PCR
cDNA của gen AtYUCCA6 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2.5µl 3 MgCl2 (25mM) 2µl 4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1µl
7 KOD plus ( 1Unit/ µl) 1µl
8 cDNA khuôn ( 10 - 20 ng/µl) 2µl
Tổng thể tích 25µl
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút 1
2 Biến tính 94 2 phút
25
3 Gắn mồi 55 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng bộ Kit PCR purification của hãng SoldGenet.
2.5.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng SoldGenet gồm các bước sau:
- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích. - Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch. - Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn. - Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -200C.
2.5.2.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng gene AtYUCCA6
Đoạn gene AtYUCCA6 sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBS
(pBluescript) có chứa promoter UBQ14. Các bước tiến hành như sau:
- Cắt đồng thời gen AtYUCCA6 và vector pBS bằng hai enzyme AscI và SpeI - Tinh sạch và thu nhận sản phẩm cắt bằng kit tinh sạch DNA
- Tiến hành phản ứng ghép nối để tạo cấu trúc pBS::AtYUCCA6. Tổng thể tich 10ul. + 3ul DNA khuân (vector pBS)
+ 1ul DNA gene AtYUCCA6 + 1ul T4 ligase buffer
+1 ul T4 ligase
+ 4ul nước cất khử trùng
Phản ứng ghép nối được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng
2.5.2.6. Phương pháp biến nạp vector tách dòng vào tế bào khả biến
Vector pBS::AtYUCCA6 được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α theo phương
pháp shock nhiệt
- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -800C đặt trên đá - Trộn 2ul DNA vào 100ul DH5α=
- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s - Bổ sung 900ul môi trường LB lỏng - Nuôi lắc ở 37oC trong 1h
- Cấy trải 100ul dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh chọn lọc Ampicilin
- Nuôi qua đêm ở 37oC.
2.5.2.7. Phương pháp chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 16 khuẩn lạc có kích thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phương pháp và thành phần phản ửng tương tự ở bảng 2.5, trong đó sử dụng enzyme Taq DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb. Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.
2.5.2.8. Phương pháp tách chiết plasmid
Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 37oC, 200v/phút trên môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh. Tiến hành thu tế bào để tách plasmid.
Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.
- Ly tâm 7000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của ... ml dịch khuẩn.
- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.
- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.
- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf mới. - Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần.
- Làm khô mẫu trong box 30 phút.
- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion. - Bổ sung RNase
- Ủ ở 370C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.5.2.9. Phương pháp định lượng DNA
Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Chuẩn bị - Máy điện di - Loading dye - Ethidium Bromide - TAE 0,5X - Agarose - Marker Cách tiến hành
- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X
- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 500C.
- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược và để yên cho gel đông lại.
- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏi bản gel.
- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl mẫu: 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel.
- Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng điện 110V trong thời gian 30 phút.
- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.
- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 5 phút.
- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.
2.5.2.10. Phương pháp xác định trình tự DNA
Trình tự gene được gửi đi giải trình tự tại công Ty COSMOGENO của Hàn Quốc và được kiểm bằng công cụ BLAST trên ngân hàng gene NCBI và phần mềm BioEdit 5.0.