- Vật liệu thực vật: Giống lúa Oryza sativa L. do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp; cây mô hình Arabidopsis, được cung cấp bởi Trung tâm ABRC của trường Đại học Ohio State, Mỹ, và được nuôi trồng in vitro tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa công nghệ sinh học, trường Đại học nông lâm Thái Nguyên.
- Các vật liệu khác:
Cấu trúc vector tách dòng pDONR201
Hệ thống vector chuyển gene pKGWFS7 mang gene chọn lọc kanamycin.
Mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)
Chủng vi khuẩn chuyển gene Ecoli DH5α của hãng Invitrogen và vi khuẩn Agrobacterium do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công
nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp.
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
N No
Gene
name Primer Sequence (5'-3') Size
1 1 RMP1 RMP1-F AAAAAGCAGGCT AATGAATTTCATTTTCAGAGCGCAGTTGCTTG 1343 bp RMP1-R AGAAAGCTGGGT GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG 2 2 RMP2 RMP2-F AAAAAGCAGGCT CTTTGTAGCCCGTGGGCTGCTTTTG 754 bp RMP2-R AGAAAGCTGGGT GGTCCCGTACGTCGCACATTTTATAGATG 3 3 attB attB1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT attB2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT 2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng có uy tín như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ).
Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS. Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine, trypton, sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học phân tử được liệt kê theo các hãng sản xuất sau đây:
- Merk: Na2EDTA, NaCL, Tris-HCL, CTAB, Acetosyringone.
- Wako: β-mercaptoethanol, Phenol: Cloroform: Izoamyl alcohol (25: 24: 1), Cloroform:Izoamyl alcohol (24:1), Izopropanol, Ethanol.
- Fermentas: dNTPs, MgCl2, Taq, mồi, PCR buffer.
- Sigma: Agarose, Ethidium bromide (EtBr), Hygromycin.
Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm:
- Môi trường nuôi khuẩn LB đặc - Môi trường nuôi khuẩn LB lỏng - Môi trường lây nhiễm RMOP - Môi trường đồng nuôi cấy RMOP - Môi trường chọn lọc RMOP
2.3.3. Thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: - Buồng cấy vô trùng
- Máy đo pH - Máy đo OD - Máy ly tâm lạnh - Máy vortex - Bể ổn nhiệt - Máy lắc ổn nhiệt - Nồi hấp khử trùng - Máy li tâm lạnh - Máy điện di
Và các trang thiết bị khác như lò vi sóng, cân điện tử, bình trụ, bình tam giác, ống eppendorf, đầu côn các loại, pipet, đĩa petri,…của phòng thí nghiệm khoa công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn.
Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray công bố về các gene biểu hiện trên cây lúa, tiến hành lựa chọn các gene biểu hiện ở hạt phấn cho nghiên cứu.
2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn và thiết kế vector chuyển gene. vector chuyển gene.
2.4.3. Nội dung 3: Đánh giá hoạt động của promoter trên cây mô hình
Arabidopsis.
2.5. Phương pháp nghiên cứu.
2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn
Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray database (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/). DNA microarray (còn gọi là DNA
chip hay gene chip) là một tấm thủy tinh hoặc nhựa trên đó có gắn các đoạn DNA thành các hàng siêu nhỏ. Các nhà nghiên cứu sử dụng các con chip như vậy để sàng lọc các mẫu sinh học nhằm kiểm tra sự có mặt hàng loạt trình tự cùng một lúc. Các đoạn DNA gắn trên chip được gọi là probe (mẫu dò). Trên mỗi điểm của chip có hàng ngàn phân tử probe với trình tự giống nhau. Các biểu hồ sơ Rice cơ sở dữ liệu (RiceXPro) là một kho lưu trữ hồ sơ biểu hiện gen có nguồn gốc từ phân tích microarray mô / cơ quan bao gồm toàn bộ sự phát triển của cây lúa trong điều kiện lĩnh vực tự nhiên, cây lúa được điều trị bằng phytohormones khác nhau, và các loại tế bào chuyên biệt / mô bị cô lập bằng microdissection (LMD). Cơ sở dữ liệu này là một phần của dự án phân tích phiên mã lúa bằng công nghệ microarray nhằm đặc trưng hóa cấu hình biểu hiện của tất cả các gen dự đoán trên cây lúa và cung cấp thông tin tham khảo có thể được sử dụng trong bộ gen chức năng. Tất cả các cấu hình biểu thức được tạo bằng cách sử dụng một nền tảng microarray với các đầu dò dựa trên các mô hình gen được quản lý thủ công trong RAP-DB và thông tin trình tự cDNA có độ dài đầy đủ của lúa trong Cơ sở dữ liệu KOME . Một số cơ sở dữ liệu microarray được quản lý, công khai nhất là: Biểu hiện gen – NCBI bằng công cụ BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sử dụng mẫu hạt phấn lúa tiến hành lựa chọn các gene biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu. Gen chuyên biệt hạt phấn là những gene biểu hiện duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc.
2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Sử dụng bộ kit bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene để tách chiết DNA tổng số từ hạt phấn lúa. Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất (https://www.qiagene.com/dna/geneomic- dna/dneasy-plant-mini-kit). Các bước tiến hành như sau:
- Bổ sung 400 up dung dịch AP1 (10mM Tris – HCl pH8.0; 1mM EDTA pH8.0) và 4 µl RNase A. Mẫu được trộn đều và ủ ở 65oC trong 10 phút.
- Bổ sung 130 µl AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút. - Ly tâm mẫu ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 2 phút.
- Chuyển cột lọc sang ống mới và bổ sung 650 µl dung dịch AW1, ly tâm 1 phút ở tốc độ 8,000 vòng/phút.
- Tiếp đến bổ sung 500 up dung dịch AW2, ly tâm 1 phút ở tốc độ 8,000 vòng/phút.
- Hòa tan DNA bằng 100 µl dung dịch AE để sử dụng cho nghiên cứu.
2.5.3. Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR
Vùng promoter nằm phía 5’ trước mã mở đầu ATG của gene được khuyếch đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP (Bảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ
1 Nước khử ion 32 µl
2 MgSO4 (25mM) 4µl
3 dNTPs (10mM) 5µl
4 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl
5 Mồi ngược (10pmol/µl) 1µl
6 KOD enzim 1µl
7 KOD plus buffer ( 1Unit/ µl) 5µl
8 DNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl) 1µl
Tổng thể tích 50µl
Phản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được thực hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min sử dụng cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự adapter attB1 và attB2; bước 2, sử dụng
10 ul sản phẩm PCR ở bước 1 làm DNA khuôn, thực hiện phản ứng ở 25 chu kỳ theo trình tự như sau: 5 chu kỳ đầu 94oC/15s, 45oC/30s và 72oC/2min ; 20 chu kỳ sau 94oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min.
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng kit tinh sạch HiGene PCR purification của hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dòng.
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của hãng Solgenet gồm các bước sau:
- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích.
- Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch. - Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn. - Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pDONR201 bằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng + DNA (10ng/ul): 2ul + Vector (75ng/ul): 1ul + BP clonase enzyme: 1ul Tổng số: 4ul
- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút - Biến nạp vào Ecoli DH5α.
Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng
Nguồn: GATEWAY Cloning Technology Manual.
2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α theo phương pháp shock nhiệt ở 42oC.
- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -800C đặt trên đá - Trộn 2 µl DNA vào 100 µl Ecoli DH5α
- Đặt trên đá 30 phút
- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s
- Bổ sung 900 µl môi trường LB lỏng - Nuôi lắc ở 37oC trong 1h
- Cấy trải 100 µl dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh chọn lọc kanamycin.
- Nuôi qua đêm ở 37oC.
2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích
thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phương pháp và thành phần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử dụng enzyme Taq DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb. Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid
Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi trường LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp. Tiến hành thu tế bào để tách plasmid.
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.
- Ly tâm 7000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của dịch khuẩn.
- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.
- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. - Ly tâm 12000v/p trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống
- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần.
- Làm khô mẫu trong box 30 phút.
- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion. - Bổ sung RNase
- Ủ ở 370C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.5.9. Phương pháp định lượng DNA
Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Cách tiến hành
- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X
- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 500C.
- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel. - Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược và để yên cho gel đông lại.
- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏi bản gel.
- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl mẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel.
- Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng điện 110V trong thời gian 30 phút.
- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.
- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 5 phút.
- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.
2.5.10. Phương pháp xác định trình tự
Để kiểm tra hiệu quả tách dòng RMP promoter, chúng tôi gửi giải trình tự gene. Trình tự gene được kiểm tra bằng các phần mềm Bioedict, NCBI/Blast….
2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS
Promoter RMP sau khi tách dòng thành công sẽ được chuyển vào vector biểu hiện pKGWFS7 có chứa gene chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR clonase. Toàn bộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Invitrogene. Trình tự promoter sẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng:
+ pDOR201-RMP (25ng/ul): 1ul + pKGWFS7 (50ng/ul): 1ul + LR clonase enzyme: 1ul + Nước cất khử ion: 1ul Tổng số: 4ul
- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút - Biến nạp vào Ecoli DH5α.
Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR
Nguồn: GATEWAY Cloning Technology Manual.
Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α bằng phương pháp shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt hiệu (như trình bày ở mục trên). Tế bào Ecoli DH5α tái tổ hợp được tách plasmid và biến nạp vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 37oC để sử dụng cho chuyển gene.
2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium
- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu giữ -80oC
- Trộn 4 µl DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến. Nhúng nhanh vào Nitơ lỏng
- Chuyển sang 37oC trong 5 phút
- Bổ sung 900 µl LB lỏng , nuôi lắc ở 28oC, 200v/p, 4hr
- Cấy trải 100 µl dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc - Nuôi ở 28oC từ 3 - 4 ngày
- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis
Phương pháp được tiến hành theo Clough (1998) [19].
2.5.13.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium: dung dịch chứa
Agrobacterium (5% sucrose và 500 ul/lit chất hoạt động bề mặt Slwet L-77). Sucrose và chất hoạt động bề mặt rất quan trọng đối với sự thành công của