Để đánh giá hoạt động của promoter RMP1 và RMP2, chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS vào cây
Arabidopsis thaliana 21 ngày tuổi thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Kết quả thu được 25 cây chuyển gene RMP1 và 20 cây RMP2 thế hệ T1, trong khi đó những cây khác không thể phát triển được trong môi trường kháng sinh
kanamycin. Những cây chuyển gen này được chuyển ra trồng trong chậu đất để thu hoạch hạt cho các thí nghiệm sâu hơn. Đồng thời để khẳng định sự có mặt của gen chỉ thị GUS trong `các dòng cây chuyển gen này tiến hành phân tích ngẫu nhiên 14 cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-F và GUS- R. PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo lí thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen cần chuyển là gen GUS có gắn promoter đặc hiệu RMP1 và RMP2. Sau khi tách chiết DNA, đã tiến hành điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra và thu được kết quả cho thấy tất cả các cây đều cho kết quả dương tính (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả phân tích cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS- F/GUS-R
Ghi chú :
M : marker 1kb ; (+) đối chứng dương tính ; (-) đối chứng âm tính ; từ 1 đến 7 : cây chuyển gene RMP1 ; từ 8-14 : cây chuyển gene RMP2
Phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa cho thấy mức độ biểu hiện khác nhau ở các cây chuyển gene RMP1 và RMP2. Gene GUS biểu hiện mạnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của hạt phấn khi được điều khiển bởi promoter RMP1 (Hình 3.5). Ở các cây chuyển gene RMP2 mức độ biểu hiện của gene GUS yếu hơn (Hình 3.5). Đồng thời cây đối chứng không chuyển gen thì hạt phấn không biểu hiện màu xanh đặc trưng do không có gen chỉ thị RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS. Mặt khác ở các bộ phận khác như lá, thân của cây được chuyển gen cũng không biểu hiện màu xanh của gen chỉ thị GUS như ở hạt phấn. Kết quả phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa của các cây chuyển gene hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích biểu hiện gene RMP1 và RMP2 dựa trên cơ sở dữ liệu heat-map (Hình 3.1). Điều này khẳng định promoter RMP1 và RMP2 hoạt động chuyên biệt ở hạt phấn của cây.
Hình 3.5. Biểu hiện của gene GUS ở cụm hoa cây chuyển gene
Ghi chú :
Màu xanh (mũi tên) là biểu hiện của gene GUS
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi kết luận :
- Đã sàng lọc được 10 gene có biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn lúa dựa trên bản đồ nhiệt heat-map, ký hiệu là RMP1 đến RMP10.
- Tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene mang promoter RMP1 và RMP2 có kích thước lần lượt là 1343 bp và 734 bp, ký hiệu là pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 :: GFP/GUS.
- Chuyển thành công vector chuyển gene vào cây Arabidopsis để đánh giá hoạt động của promoter. Phân tích 14 cây chuyển gene bằng PCR đều cho kết quả dương tính với gene GUS. Phân tích biểu hiện gene GUS. Cả hai promoter đều hoạt động ở hạt phấn ở cây chuyển gene RMP1 và RMP2.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện về khả năng hoạt động của promoter RMP1 và RMP2 ở cây lúa và mở rộng trên các đối tượng cây trồng khác trước khi đưa vào ứng dụng điều khiển các gene mục tiêu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt Nam. Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.
2. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2014), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 12 và cả năm 2014 ngành Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Trung tâm tin học và thống kê, Hà Nội.
3. Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò của yếu tố điều hòa Cis trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học, 37(3), tr. 370-383.
4. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí công nghệ sinh học, 5(1), tr.118.
5. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene ở thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Võ Thị Thương Lan (2011), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo Dục Việt Nam.
7. Lê Duy Thành. (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
8. Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền học , NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016) ‚“Nghiên cứu hoạt động của promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống chịu arsenic trong cây mô hình Arabidopsis”, tạp chí Công nghệ Sinh học
14(3), tr. 499-505.
10. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
12. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M. (1997), “Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup- shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp. 841 - 857.
13. Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun MY, Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show severe male sterility”, Plant Breed , 129, pp. 647 – 651.
14. Benfey P. N., Chua N. H. (1990), “ The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, 250(4983), pp. 959966.
15. Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp. 1632 -1642.
16. Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z. (2013), “ AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”,
Mol Plant, 6, pp. 1187-1201.
17. Christensen A.H. & Quail P.H. (1996), “ Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp. 213 - 218.
18. Conkling M. A., C. L. Cheng, Y. T. Yamamoto and H. M. Goodman (1990), “ Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant Physiology, 93(3), pp. 1203 -1211.
19. Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp. 735 - 743.
helix domain-containing protein 3 (ChChd3) into the mitochondrial
intermembrane space”, J Biol Chem,
287, pp. 39480-39491.
21. Davis D. L., Nielsen M. T. (1999), Tobaco Production, Chemistry and technology. B Blackwell Science, 467.
22. Dionisio G., Madsen C. K., Holm P. B., Welinder K. G., Jorgenesen M., Stoger E., Arcalis E., Brinch – Pedersen H. (2011), “Cloning and characterization of purple acid phosphatase phytases from wheat (Triticum aestivum L.), barley(Hordeum vulgage L.), maize (Zea maize L.) and rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiol, 156, pp. 1087-1100.
23. Ditt R. F., Nester E. W. and Comai L. (2005), “ The plant cell defense andAgrobacterium tumefaciens” , FEMS Microbiology letters, 247, pp. 207-213.
24. Gelvin S. B. (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation t he biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp. 16 - 37.
25. Grierson C. S., Barnes S. R., Chase M. W., Clarke M., Grierson D., Edwards K. J., Jellis G. J., Jones D. J., Knapp S., OldroydG., Poppy G., Temple P., Williams R., and Bastow R., (2011), “One hundred important questions facing plant science research”, New Phytologist,
192, pp. 6 –12.
26. Grover A., Twell D. & Schleiff E. (2016). Pollen as a target of environmental changes, Plant Reprod, 29, https://doi.org/10.1007/s00497-016-0285-7.
27. Hays J. B. (2002), “Arabidopsis thaliana, a versatile model system for study of eukaryotic genome-maintenance functions”, DNA repair , 1(8), pp. 579- 600.
28. Ho M. W., A. Ryan and J. Cummins (1999), “ Cauliflower mosaic viral promoter-a recipe for disaster?”, Microbial Ecology in Health and Disease, 11(4), pp. 194-197.
29. Honys D., Oh S. A., Renak D., Donders M., Solcova B., Johnson J. A., Boudova R., Twell D. (2006), “ Identification of microspore-active promotes that allow targeted manipulation of gene expression at early stages of microgametogenesis in Arabidospsis” , BMC Plant Biol, 6, pp. 31.
30. Hohn T., Futterer J. (1992), Transcriptional and translational control of gene expression in cauliflower mosaic virus”, Current opinion in genetics & development, 2(1), pp. 90 - 96.
31. Huang J. W, J. T. Chen, W. P. Yu, L. F. Shyur, A. Y. Wang, H. Y. Sung and J. C. Su (1996), “ Complete structures of three rice sucrose synthase isogenes and differential regulation of their expressions”,
Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60(2), pp. 233-239.
32. Huraba P., Honys D., Twell D., Capková V., Tupý J. (2005), “Expression of beta-galactosidase and beta-xylosidase genes 332 during microspore and pollen development” , Planta , 220, pp. 931-940.
33. Jefferson R. (1987). GUS: Histochemical Staining with X-Gluc, http://stockingerlab.osu.edu, ngày 26/11/2001.
34. Liu L., Y. Zhou, M. W. Szczerba, X. Li and Y. Lin (2010), “Identification and application of a rice senescence-associated promoter”, Plant physiology, 153(3), pp. 1239 -1249.
35. Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N. Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K. (2007), “Functional analysis of a NAC – type transcription factor
OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress – responsive gene expression in rice”, Plant J, 1(4), pp. 617-630.
36. Noad R. J., D. S. Turner and S. N. Covey (1997), “ Expression of functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic acids research, 25(6), pp. 1123 – 1129.
37. Noir S., Brautigam A., Colby T., Schmidt J., Panstruga R. (2005), “A reference map of the Arabidospsis thaliana mature pollen proteome”,
Biochem Biophys Res Commun, 337, pp. 1257-1266
38. Paupiere M. J., van Heusden A. W., Bovy A. G. (2014), “The metabolic basis of pollen thermo-tolerance: perspectives for breeding”,
Metabolites, 4, pp. 889-920.
39. Safadi F., Reddy V. S., Reddy A. S. (2000), “A pollen-specific novel calmodulinbinding protein with tetratricopeptide repeats”, J Biol Chem,
275, pp 35457-35470.
40. Swapna L., Khurana R., Kumar S.V., Tyagi A.K., Rao K.V. (2011), “Pollen – specific expression of Oryza sativa indica pollen allergene gene (OSIPA) promoter in rice and Arabidospsis transgenneic systems”, Mol. Biotechnol, 48 49-50, 10.1007/s 12033-010-9347-5.
41. Tan H., Liang W., Hu J., Zhang D. (2012), “ MTR1 encodes a secretory fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in rice”, Dev Cell, 22, pp. 1127-37.
42. Tan C. M., Chen R. J , Zhang J. H., Gao X. L., Li L. H., Wang P. R., Deng X. J., Xu Z. J. (2013), “ OsPOP5, a prolyl oligopeptidase family gene from rice confers abiotic stress tolerance in Escherichia coli”, Int J Mol Sci , 14, pp. 20204-20219.
43. Tanthanuch W., Chantarangsee M., Maneesan J., Ketudat-Cairns J. (2008), “ Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase
family 35 genes from rice (Oryza sativa L.)”, BMC Plant Biol, 8, pp. 84.
44. The Arabidopsis Genome Initiative (2000), “Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana”, Nature, 408, pp. 796 - 815.
45. Tripathi L., Sowdhamini R. (2006), “ Cross geneome comparisons of serine proteases in Arabidospsis and rice, BMC Geneomics, 7, pp. 200.
46. Turner D. S., D. G. McCallum and S. N. Covey (1996), “ Roles of the 35S promoter and multiple overtapping domains in the pathogenicity of the pararetrovirus cauliflower mosaic virus”, Journal of virology, 70(8), 4514.
47. Yin Y., L. Chen and R. Beachy (1997), “ Promoter elements required for phloem- specific gene expression from the RTBV promoter in rice”,
The Plant Journal, 12 (5), pp. 1179-1188.
48. Yu W. P., A. Y. Wang, R. H. Juang, H. Y. Sung and J. C. Su (1992), “ Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic DNA”, Plant molecular biology, 18(1), pp. 139 -142.
PHỤ LỤC
( Bài báo khoa học )
BÁO CÁO KHOA HỌC PROCEEDINGS
HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2018 “ SÀNG LỌC VÀ TÁCH DÒNG MỘT SỐ PROMOTER CHUYÊN BIỆT
HẠT PHẤN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L.)”
Nguyễn Tiến Dũng*, Trần Thị Mai, Trương Kim Oanh, Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hữu Thọ, Ngô Xuân Bình