Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa. Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9].
Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gene chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X-gluc theo phương pháp của Jefferson (1987).
1. Ngâm mô trong dung dịch nhuộm. Ống microfuge hoạt động tốt cho các mẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn.
2. Hút chân không thâm nhập nhanh. 3. Ủ mô qua đêm ở 37oC.
4. Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi nhận rõ màu xanh lam đặc trưng . Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33].
Sự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách từ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit (QIAGEN, Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:
5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’. PCR theo chu trình nhiệt 94oC/2 phút, 30 chu kỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa
Dựa vào kết quả phân tích 64 dữ liệu công bố trên microarray database (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/) với các gene biểu hiện ở hạt phấn lúa chúng tôi đã xác định được 1.080 gene chuyên biệt cho hạt phấn (gen biểu hiện duy nhất ở hạt phấn), trong đó có 410 gene biểu hiện ở giai đoạn đầu hình thành bào tử (early-microspore) và 672 gene ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành (late pollen). Từ dữ liệu này chúng tôi lựa chọn 10 gene ứng viên có biểu hiện mạnh ở hạt phấn lúa, ký hiệu là RMP (rice microspore preferred gene) từ 1 đến 10 (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Mức độ biểu hiện của gene được thể hiện bằng màu sắc trên bản đồ nhiệt (heat map), dải màu từ đen đến vàng cho biết mức độ biểu hiện gene từ thấp đến cao (Hình 3.1). Phân tích vai trò của gene liên quan đến hạt phấn chúng tôi nhận thấy : Gene RMP1 ( Os01g0533400) mã hóa cho protein Glycoside hydrolase 35 (GH35) có vai trò quan trọng trong hình thành cấu trúc tế bào [43]. Hiện có khoảng 15 gene mã hóa các protein nhóm GH35 được xác định ở cây lúa, trong đó có một số gene liên quan đến biểu hiện ở hạt phấn như OsBgal10, OsBgal11, OsBgal15, AtGAL7
và AtGAL15 [32]. Gene RMP2 (Os04g0561900) mã hóa Peptidase S9A protein thuộc nhóm prolyl oligopeptidase (POPs) liên quan đến quá trình tổng hợp hormone tăng cường tính chống chịu của tế bào trong điều kiện stress [42]. Cho tới nay đã có 23 gene mã hóa cho nhóm protein oligopeptidase được tìm thấy trên cây Arabidopsis và cây lúa [45]. Gene RMP3 (Os12g0637100) mã hóa purple acid phosphatase thuộc nhóm protein mettallophosphoesterase. Một số gene mã hóa protein này như OsPAPhyla, OsPAPhylB, NtPAP12 và AtPAP10 được chứng minh có vai trò đến sự biểu hiện của gene trong quá trình phát triển của hạt phấn ở lúa, thuốc lá và
trò quan trọng kiểm soát quá trình phát triển của ống phấn và biểu hiện mạnh trong suốt quá trình phát triển của hạt phấn, xác định được 8 gene RLKs mã hóa protein kinase ở cây Arabidopsis trong đó 6 gene biểu hiện cao ở hạt phấn [16]. Gene RMP5 (Os06g0681100) mã hóa protein tetratricopetide liên quan đến sự nảy mầm của hạt phấn được chứng minh biểu hiện mạnh ở các giai đoạn phát triển của hạt phấn ngô và Arabidopsis [39]. Gene RMP6 ( Os12g0637900) mã hóa CHCH protein, vai trò của protein này ít được nghiên cứu trên thực vật đặc biệt là ở hạt phấn [20]. Gene RMP7 (Os03g0381000)
mã hóa Aldose 1- epimerase protein được chứng minh biểu hiện ở hạt phấn cây Arabidopsis giai đoạn trưởng thành [37]. Tuy nhiên ở lúa chưa có một nghiên cứu nào được công bố. Gene RMP8 (Os01g0899100) mã hóa peptidase C1A có vai trò khác nhau, tuy nhiên chưa được chứng minh ở hạt phấn lúa cũng như các cây trồng khác. Gene RMP9 (Os04g0650200) mã hóa lipolytic protein có vai trò khác nhau trong quá trình phát triển của hạt phấn. Gene RMP10 (Os07g0664600) mã hóa glucose/ribitol dehydrogenease protein có vai trò chủ yếu tăng cường khả năng chịu mặn giai đoạn nảy mầm của hạt.
Bảng 3.1. Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa và vùng promoter tương ứng trong nghiên cứu
STT Mã số trên ngân
hàng gene Protein mã hóa
Kích thước vùng promoter khuếch đại
RMP1 Os01g0533400 Glycoside hydrolase, family 35 protein 1,343 bp (-18 to -1,360) RMP2 Os04g0561900 Peptidase S9A, prolyl oligopeptidase family 754 bp (-97 to -850) RMP3 Os12g0637100 Similar to Purple acid phosphatase 1,420 bp (-14 to -1,433) RMP4 Os12g0605900 Similar to Kinase like protein 1,294 bp (-98 to -1,391) RMP5 Os06g0681100 Tetratricopeptide-like helical domain containing protein 1,514 bp (-144 to -1,657) RMP6 Os12g0637900 CHCH domain containing protein 1,962 bp (-19 to -1,980) RMP7 Os03g0381000 Similar to Aldose 1-epimerase-like protein 2,046 bp (-5 to -2,051) RMP8 Os01g0899100 Peptidase C1A, papain family protein 2,053 bp (-2 to -2,054) RMP9 Os04g0650200 Lipolytic enzyme, G-D-S-L family protein 1,934 bp (-5 to -1,939)
Hình 3.1. Bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện của các gene RMP ở hạt phấn
Ghi chú :
Mức độ biểu hiện gene được thể hiện bằng màu sắc từ màu đen đến màu vàng.
3.2. Tách dòng và thiết kế vector
Lựa chọn 2 gen RMP1 và RMP2 để tách dòng promoter và thiết kế vector chuyển gene nhằm đánh giá khả năng hoạt động của promoter ở hạt phấn thông qua gene chỉ thị GUS. Toàn bộ vùng promoter (5’upstream) của gene được khuyếch đại bằng PCR và đưa vào vector nhân dòng pDONR201 theo phương pháp Gateway. Promoter được đưa vào vector pDONR201 bằng phản ứng BP sau đó biến nạp vào chủng Ecoli DH5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin. Kết quả sàng lọc tế bào tái tổ hợp bằng PCR sử dụng cặp mồi RMP/attB2. Kết quả cho thấy đối với promoter RMP1, kiểm tra ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1-F/attB2. Kết quả điện di trên gel thu được 2 khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,34 kb tương ứng với kích thước mong muốn của promoter (Hình 3.2a). Để kiểm tra kết quả tách dòng, nuôi tăng sinh chủng số 2 , tách plasmid và gửi đi giải trình tự gene tại công ty COSMOGENETECH (http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) của Hàn Quốc. Kết quả giải trình
tự gene được kiểm tra trên ngân hàng gene NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm Bioedit (http://bioedit. software.informer.com/7.2/). Kết quả cho thấy toàn bộ trình tự promoter
RMP1 tách dòng trùng khớp với trình tự promoter của gene trên ngân hàng gene. Tương tự tiến hành tách dòng promoter RMP2, kiểm tra ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc trên môi trường có kháng sinh chọn lọc bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP2-F/attB2 đã thu được cả 4 khuẩn lạc đều cho kích thước khoảng 754 bp, tương ứng với kích thước của vùng promoter RMP2 (Hình 3.2d). Tiến hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 1, tách plasmid và giải trình tự gene thu được kết quả trùng khớp với promoter gene RMP2 trên ngân hàng gene NCBI.
Từ các kết quả này chứng tỏ đã tách dòng thành công promoter RMP1 và
RMP2, ký hiệu lần lượt là pDORMP1-1 và pDORMP2-1. Để đánh giá khả năng hoạt động, promoter RMP1 và RMP2 được gắn vào vector chuyển gene pKGWFS7 theo phương pháp Gateway. Bằng phản ứng LR toàn bộ trình tự promoter được chèn vào phần ccdB giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 để điều khiển gen chỉ thị GFP và GUS hoạt động. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp bằng PCR cho thấy, cả 3 khuẩn lạc đều dương tính với promoter RMP1 khi sử dụng cặp mồi RMP1-F và RMP1-R (Hình 3.2b ), điều đó chứng tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1 với vector pKGWFS7 đã thành công. Tương tự, kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F và RMP2-R cho thấy 3 khuẩn lạc (1,2,3) cho kích thước khoảng 754 bp tương ứng với chiều dài của promoter RMP2, khuẩn lạc số 4 có kích thước lớn hơn 754 bp nên loại bỏ (Hình 3.2c ). Kết quả này chứng tỏ promoter RMP1 và RMP2 đã được gắn thành công vào vector chuyển gene pKGWFS7 điều khiển gene chỉ thị GFP và GUS. Ký hiệu lần lượt là pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 :: GFP/GUS (Hình 3.3).
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector chuyển gene
pKGWFS7
Ghi chú :
(a,b) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP1-F/attB2 (a), và RMP1-F/R (b) cho kích thước tương ứng 1,34kb, (c,d) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F/R (c), và RMP2-F/attB2 (d) cho kích thước tương ứng 754 bp. M : thang chuẩn 1kb ; 1-4 : thứ tự các khuẩn lạc được kiểm tra.
Hình 3.3. Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP
Ghi chú :
(a) Cấu trúc vector pKG7-RMP1 :: GFP/GUS (b) Cấu trúc vector pKG7-RMP2 :: GFP/GUS ; LB : Left border, RB : right border, T35S : trình tự kết thúc, Kam : vùng gene chọn lọc kanamycin
3.3. Kết quả nghiên cứu chuyển gene và phân tích biểu hiện gen GUS
Để đánh giá hoạt động của promoter RMP1 và RMP2, chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS vào cây
Arabidopsis thaliana 21 ngày tuổi thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Kết quả thu được 25 cây chuyển gene RMP1 và 20 cây RMP2 thế hệ T1, trong khi đó những cây khác không thể phát triển được trong môi trường kháng sinh
kanamycin. Những cây chuyển gen này được chuyển ra trồng trong chậu đất để thu hoạch hạt cho các thí nghiệm sâu hơn. Đồng thời để khẳng định sự có mặt của gen chỉ thị GUS trong `các dòng cây chuyển gen này tiến hành phân tích ngẫu nhiên 14 cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-F và GUS- R. PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo lí thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen cần chuyển là gen GUS có gắn promoter đặc hiệu RMP1 và RMP2. Sau khi tách chiết DNA, đã tiến hành điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra và thu được kết quả cho thấy tất cả các cây đều cho kết quả dương tính (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả phân tích cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS- F/GUS-R
Ghi chú :
M : marker 1kb ; (+) đối chứng dương tính ; (-) đối chứng âm tính ; từ 1 đến 7 : cây chuyển gene RMP1 ; từ 8-14 : cây chuyển gene RMP2
Phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa cho thấy mức độ biểu hiện khác nhau ở các cây chuyển gene RMP1 và RMP2. Gene GUS biểu hiện mạnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của hạt phấn khi được điều khiển bởi promoter RMP1 (Hình 3.5). Ở các cây chuyển gene RMP2 mức độ biểu hiện của gene GUS yếu hơn (Hình 3.5). Đồng thời cây đối chứng không chuyển gen thì hạt phấn không biểu hiện màu xanh đặc trưng do không có gen chỉ thị RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS. Mặt khác ở các bộ phận khác như lá, thân của cây được chuyển gen cũng không biểu hiện màu xanh của gen chỉ thị GUS như ở hạt phấn. Kết quả phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa của các cây chuyển gene hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích biểu hiện gene RMP1 và RMP2 dựa trên cơ sở dữ liệu heat-map (Hình 3.1). Điều này khẳng định promoter RMP1 và RMP2 hoạt động chuyên biệt ở hạt phấn của cây.
Hình 3.5. Biểu hiện của gene GUS ở cụm hoa cây chuyển gene
Ghi chú :
Màu xanh (mũi tên) là biểu hiện của gene GUS
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi kết luận :
- Đã sàng lọc được 10 gene có biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn lúa dựa trên bản đồ nhiệt heat-map, ký hiệu là RMP1 đến RMP10.
- Tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene mang promoter RMP1 và RMP2 có kích thước lần lượt là 1343 bp và 734 bp, ký hiệu là pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 :: GFP/GUS.
- Chuyển thành công vector chuyển gene vào cây Arabidopsis để đánh giá hoạt động của promoter. Phân tích 14 cây chuyển gene bằng PCR đều cho kết quả dương tính với gene GUS. Phân tích biểu hiện gene GUS. Cả hai promoter đều hoạt động ở hạt phấn ở cây chuyển gene RMP1 và RMP2.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện về khả năng hoạt động của promoter RMP1 và RMP2 ở cây lúa và mở rộng trên các đối tượng cây trồng khác trước khi đưa vào ứng dụng điều khiển các gene mục tiêu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt Nam. Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.
2. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2014), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 12 và cả năm 2014 ngành Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Trung tâm tin học và thống kê, Hà Nội.
3. Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò của yếu tố điều hòa Cis trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học, 37(3), tr. 370-383.
4. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí công nghệ sinh học, 5(1), tr.118.
5. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene ở thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Võ Thị Thương Lan (2011), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo Dục Việt Nam.
7. Lê Duy Thành. (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
8. Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền học , NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016) ‚“Nghiên cứu hoạt động của promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống chịu arsenic trong cây mô hình Arabidopsis”, tạp chí Công nghệ Sinh học
14(3), tr. 499-505.
10. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
12. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M. (1997), “Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup- shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp. 841 - 857.
13. Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun MY, Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show severe male sterility”, Plant Breed , 129, pp. 647 – 651.
14. Benfey P. N., Chua N. H. (1990), “ The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, 250(4983), pp. 959966.
15. Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp. 1632 -1642.
16. Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z. (2013), “ AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”,
Mol Plant, 6, pp. 1187-1201.
17. Christensen A.H. & Quail P.H. (1996), “ Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp. 213 - 218.
18. Conkling M. A., C. L. Cheng, Y. T. Yamamoto and H. M. Goodman (1990), “ Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant Physiology, 93(3), pp. 1203 -1211.
19. Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp. 735 - 743.
helix domain-containing protein 3 (ChChd3) into the mitochondrial
intermembrane space”, J Biol Chem,