Lựa chọn 2 gen RMP1 và RMP2 để tách dòng promoter và thiết kế vector chuyển gene nhằm đánh giá khả năng hoạt động của promoter ở hạt phấn thông qua gene chỉ thị GUS. Toàn bộ vùng promoter (5’upstream) của gene được khuyếch đại bằng PCR và đưa vào vector nhân dòng pDONR201 theo phương pháp Gateway. Promoter được đưa vào vector pDONR201 bằng phản ứng BP sau đó biến nạp vào chủng Ecoli DH5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin. Kết quả sàng lọc tế bào tái tổ hợp bằng PCR sử dụng cặp mồi RMP/attB2. Kết quả cho thấy đối với promoter RMP1, kiểm tra ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1-F/attB2. Kết quả điện di trên gel thu được 2 khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,34 kb tương ứng với kích thước mong muốn của promoter (Hình 3.2a). Để kiểm tra kết quả tách dòng, nuôi tăng sinh chủng số 2 , tách plasmid và gửi đi giải trình tự gene tại công ty COSMOGENETECH (http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) của Hàn Quốc. Kết quả giải trình
tự gene được kiểm tra trên ngân hàng gene NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm Bioedit (http://bioedit. software.informer.com/7.2/). Kết quả cho thấy toàn bộ trình tự promoter
RMP1 tách dòng trùng khớp với trình tự promoter của gene trên ngân hàng gene. Tương tự tiến hành tách dòng promoter RMP2, kiểm tra ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc trên môi trường có kháng sinh chọn lọc bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP2-F/attB2 đã thu được cả 4 khuẩn lạc đều cho kích thước khoảng 754 bp, tương ứng với kích thước của vùng promoter RMP2 (Hình 3.2d). Tiến hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 1, tách plasmid và giải trình tự gene thu được kết quả trùng khớp với promoter gene RMP2 trên ngân hàng gene NCBI.
Từ các kết quả này chứng tỏ đã tách dòng thành công promoter RMP1 và
RMP2, ký hiệu lần lượt là pDORMP1-1 và pDORMP2-1. Để đánh giá khả năng hoạt động, promoter RMP1 và RMP2 được gắn vào vector chuyển gene pKGWFS7 theo phương pháp Gateway. Bằng phản ứng LR toàn bộ trình tự promoter được chèn vào phần ccdB giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 để điều khiển gen chỉ thị GFP và GUS hoạt động. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp bằng PCR cho thấy, cả 3 khuẩn lạc đều dương tính với promoter RMP1 khi sử dụng cặp mồi RMP1-F và RMP1-R (Hình 3.2b ), điều đó chứng tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1 với vector pKGWFS7 đã thành công. Tương tự, kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F và RMP2-R cho thấy 3 khuẩn lạc (1,2,3) cho kích thước khoảng 754 bp tương ứng với chiều dài của promoter RMP2, khuẩn lạc số 4 có kích thước lớn hơn 754 bp nên loại bỏ (Hình 3.2c ). Kết quả này chứng tỏ promoter RMP1 và RMP2 đã được gắn thành công vào vector chuyển gene pKGWFS7 điều khiển gene chỉ thị GFP và GUS. Ký hiệu lần lượt là pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 :: GFP/GUS (Hình 3.3).
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector chuyển gene
pKGWFS7
Ghi chú :
(a,b) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP1-F/attB2 (a), và RMP1-F/R (b) cho kích thước tương ứng 1,34kb, (c,d) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F/R (c), và RMP2-F/attB2 (d) cho kích thước tương ứng 754 bp. M : thang chuẩn 1kb ; 1-4 : thứ tự các khuẩn lạc được kiểm tra.
Hình 3.3. Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP
Ghi chú :
(a) Cấu trúc vector pKG7-RMP1 :: GFP/GUS (b) Cấu trúc vector pKG7-RMP2 :: GFP/GUS ; LB : Left border, RB : right border, T35S : trình tự kết thúc, Kam : vùng gene chọn lọc kanamycin