Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Phương pháp xác định vi sinh vật
2.4.3.1. Phương pháp xác định Coliform và Escherichia coli giả định
theo TCVN 6187-2: 1996 (ISO 9308-2: 1990)
Chất lượng nước - xác định - phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi
khuẩn Coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giả định. Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất).
Nguyên tắc: Cấy các phần mẫu thử đã được pha lỗng hoặc khơng pha lỗng vào một dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza. Kiểm tra các ống thử sau 24h và 48h nuôi ở nhiệt độ 35°C hoặc 37°C; cấy chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện đục kèm sinh khí vào một ống mơi trường khẳng định chọn lọc hơn và khi muốn tìm E. coli giả định cấy vào một môi trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol. Nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48h ở nhiệt độ 35°C hoặc 37°C để xác định các loại Coliform chịu nhiệt và E. coli giả định. Bằng các bảng thống kê, tính tốn số xác suất cao nhất các dạng Coliform,
Coliform chịu nhiệt và E. coli giả định có thể có trong 100ml mẫu thử từ số
các ống thử có kết quả xác nhận dương tính.
Ni cấy: Chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu cấy vào môi trường phân lập các phần mẫu thử theo ISO 8199.
Cấy và ủ mẫu vào môi trường Trypton Lauryl Sulfat (TLS): Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 dãy liên tiếp mỗi dãy chứa 5 ống môi trường TLS. Cấy 10ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống đầu tiên, 1ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống tiếp theo và 0,1ml mẫu thử vào mỗi ống ở dãy 5 ống cuối cùng.
Nuôi cấy ở 37ºC, đếm số lượng các ống TLS cho kết quả dương tính ở mỗi dãy sau 24h - 48h.
Để khẳng định Coliform: Cấy chuyển một vòng que cấy từ mỗi ống TLS dương tính sang một ống nghiệm chứa môi trường Brilliant Green Bile 2% broth (BGB), ủ ở 30ºC trong 24 h.
Để khẳng định E. coli cần thực hiện tiếp:
Cấy chuyển và ủ môi trường Escherichia coli broth (EC): Cấy chuyển
một vòng que cấy từ mỗi ống nghiệm TLS dương tính sang mỗi ống nghiệm đựng canh thang EC, ủ ở 44ºC trong 24h ± 2h. Đếm số lượng các ống EC cho kết quả dương tính ở mỗi dãy. Các ống dương tính trong mơi trường EC được cấy chuyển sang môi trường nước pepton không indol để kiểm tra sự sinh Indol.
Cấy và ủ môi trường nước pepton khơng Indol:
Cấy một vịng que cấy canh khuẩn từ mỗi ống nghiệm EC dương tính sang mỗi ống nghiệm đựng 5-10ml nước pepton không Indol, ủ ở 44ºC trong 24h ± 2h. Sau đó kiểm tra sự sinh khí Indol.
Kiểm tra sự sinh Indol:
Nhỏ 0,5 ml thuốc thử Kovac vào các ống nghiệm chứa nước pepton không Indol đã được ủ, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ phía trên chứng tỏ là có mặt E. coli. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E. coli dương tính ở mỗi độ pha lỗng của mẫu.
Tính kết quả: Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli, Coliform dương
tính ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng bảng thống kê trong ISO 8199, số có xác suất cao nhất của vi khuẩn Coliform và E. coli giả định.
2.4.3.2. Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt
Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng
Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng định
đặc tính sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE,... Mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hố đặc trưng tương ứng.
Bao gồm các bước sau:
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Nutrient Broth. Bồi dưỡng ở 370C/16 - 24h
Cấy 1ml dịch sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc trên 2 môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) và Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann (MKTTn). Bồi dưỡng ở 430C/24h
Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD). Bồi dưỡng 370C/24h
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định đặc tính sinh hóa: lên men đường, H2S, Indole, urease,
citrate…
Salmonella dương tính/âm tính trong 25g mẫu Bước 1: Lấy mẫu, đồng nhất và tăng sinh lần 1
Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ vơ trùng nghiền nhỏ. Cân chính xác trong điều kiện vơ trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1. Để tủ ấm 370C/16 - 24h.
Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc): Lắc để
trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vơ trùng hút 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24h.
Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD (Xylose Lysine Deoxycholate Agar - loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn
Salmonella). Sau đó bồi dưỡng ở 370C/24h rồi đọc kết quả.
- Salmonella phát triển mạnh, khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, ở giữa có tâm đen (do sản sinh H2S), đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, khơng lên men lactose.
Bước 4: Giám định đặc tính sinh vật, hóa học
Từ mơi trường phân lập, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 ì 1 - 3àm, khng cú giỏp mơ, khơng sản sinh nha bào, di động được do có lơng, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm.
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men đường glucose (+), lactose (-), H2S (+), Indol 370C (-), urease (-), citrat (+), catalase (+).
Kiểm tra khả năng sản sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã cấy thuần, cấy vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có). Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’s vào ống nghiệm.
+ Phản ứng dương tính ( + ): Trên bề mặt mơi trường thí nghiệm xuất hiện một vịng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’s màu cafe và Indole không màu).
+ Phản ứng âm tính ( - ): Khơng có sự thay đổi màu.
- Phản ứng Catalase: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau
khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại khơng có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
Bước 5: Giám định vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)
- Cách tiến hành tách chiết DNA.
* Tách chiết DNA vi khuẩn bằng Kit QIAgen
Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl. Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15 giây. Ủ ở 560C trong 10 phút.
Bước 3: Thêm 200µl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây. Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy
Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1 khơng để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 8.000 vịng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vịng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần
dung dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số.Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
- Cách tiến hành chạy PCR.
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu DNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5
Nước khử ion (DEPC – treated) 6.5
Tổng thể tích 25
Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng này phát hiện gen invA (Malorny et al., 2003)
Tên mồi Trình tự nucleotid Kích
thước Mồi xi 5’-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA– 3’
284 bp Mồi ngược 5’ – TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C- 3’
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
30
Gắn mồi 60 30 giây
Tổng hợp sợi mới 72 30 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
- Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
-Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1x hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lị vi sóng ở 1000C trong 5 phút, để nguội 45-500C bổ sung 10µl Red gel (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả.
- Mẫu dương tính với vi khuẩn khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên 284 bp.
- Mẫu âm tính khi khơng xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại
2.4.3.2. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy và phân lập trên môi trường XLD, cho vào các ống nghiệm chứa môi trường BHI đã pha chế, đem nuôi trong tủ ấm 370C/24h.
Sau đó tiến hành tiêm xoang phúc mạc chuột nhắt trắng với liều 0,5ml canh trùng/con. Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm. Khi chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn trên môi trường XLD.
Đối với chuột nhắt trắng đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng 0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất. Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết tiến hành mổ và khám bệnh tích rồi phân lập lại trên mơi trường XLD.
2.4.3.3. Phương pháp xác định tính mẫn cảm một số loại kháng sinh và hóa
dược của vi khuẩn
* Nguyên lý chung: Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên mơi trường ni cấy.
* Mục đích: Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn.
* Tiến hành: Dùng pipet hút 0,1ml canh khuẩn 24h ở môi trường BHI
(nồng độ 10-1) vào ống nghiệm trộn đều với 0,9ml nước muối sinh lý 0,9%, ta được nồng độ 10-2, sau đó ta lại hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 2 ta được nồng độ 10-3 tiếp tục hút 0,1ml sang ống nghiệm thứ 3 ta được nồng độ 10-4. Ống thứ 3 được sử dụng làm kháng sinh đồ.
Hút 0,5ml đã pha loãng nồng độ 10-4, nhỏ toàn bộ dung dịch này lên mặt thạch, sau đó dùng que cấy vòng láng đều dung dịch trên môi trường thạch đĩa cho đến khi mặt đĩa thạch này khô.
Đặt nhẹ các khoanh giấy kháng sinh chế sẵn lên mặt thạch đĩa. Các khoanh giấy kháng sinh đặt cách nhau 2cm không quá 7 khoanh giấy kháng sinh trong một đĩa thạch. Sau đó bồi dưỡng ở tủ ấm 370C/24h. Đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn.
+ Rất mẫn cảm: ф > 20mm
+ Mẫn cảm trung bình: ф từ 15 - 20mm + Mẫn cảm yếu: ф từ 10 - 14mm