giới và ở Việt Nam
Hiện nay đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về CGA trong cà phê và thấy rằng hàm lượng của CGA trong cà phê phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hàm lượng CGA thay đổi nhiều nhất dựa theo yếu tố giống cà phê nhau:
Hàm lượng CGA không khác nhau đáng kể ở các khu vực trồng, nhưng lại khác nhau giữa các mùa vụ đối với giống cà phê Arabica ở Brazil, hàm lượng CGA đạt khoảng 60 - 65mg/g (6 – 6,5%) chất khô.
Hàm lượng CGA trong mẫu nhân cà phê xanh của 21 giống khác nhau của hai khu vực Cameroon và Congo có hàm lượng thay đổi từ 0,8% - 11,9% chất khô (C. Campa và cộng sự, 2005).
Hàm lượng CGA trong cà phê rang có thể bị ảnh hưởng bởi giống cà phê bởi vi hàm lượng CGA ở cà phê Robusta cao hơn Arabica.
Hàm lượng CGA khác nhau trong các mẫu cà phê rang chỉ đạt từ 5,25 - 17,1mg/g.
Đối với nhân cà phê xanh chất lượng thấp chứa hàm lượng polyphenol 4,5%, hàm lượng CGA là 8,35%.
Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về quá trình thu nhận các hợp chất tự nhiên trong đó có CGA từ cà phê nhân (cà phê xanh) và đã công bố nhiều phương pháp khác nhau.
Cao cà phê xanh được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt. Tiến hành nghiên cứu bột và dịch chiết với các dung môi isopropanol và nước với các tỉ lệ khác nhau. Khả năng chống oxi hóa của bột và dịch chiết này được tìm thấy. Với dung môi tỉ lệ isopropanol: nước là 60 : 40 hàm lượng của cao chiết là cao nhất: 27% đối với cà phê arabica và 29% đối với cà phê Robusta. Hàm lượng polyphenol tổng đạt 31,7% - 32,2% trong cao chiết này.
Với nguồn nguyên liệu là bột cà phê xanh, quá trình tách chiết các hợp chất được khảo sát. Quá trình tách chiết sử dụng methanol 60% với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 40ml/g nguyên liệu trong thời gian 90 giờ cho hàm lượng CGA thu nhận đạt 16mg/g nguyên liệu.
Rohit Upadhyay và cộng sự đã chứng minh rằng trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng (MAE) được coi là sự lựa chọn tiềm năng so với phương pháp ly trích sử dụng dung môi để ly trích các hợp chất phenol từ thực vật. Đối với
nguyên liệu là nhân cà phê xanh, các dịch ly trích với dung môi là cồn và nước với sự hỗ trợ của vi sóng được xác định hiệu suất trích ly, hàm lượng chlorogenic acid, caffeine và polyphenol tổng. Dịch trích ly cũng được đánh giá khả năng khử gốc tự do (1.1 -diphenyl-β-picrylhydrazyl) (Rohit Upadhyay, 2013). Trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ: 50oC, thời gian 5 phút, điện năng 800W, hàm lượng chlorogenic acid đạt cao nhất với dung môi là nước; hàm lượng chlorogenic acid là 31 - 62%. Hiệu suất ly trích bằng MAE trong điều kiện tối ưu cao hơn so với ly trích bằng dung môi trong cùng điều kiện 5 phút, 50oC. Các dịch chiết có hoạt tính khử gốc tự do >75% ngay cả ở nồng độ 25vòng/phút. Quá trình MAE có thể dự đoán và kiểm soát được khi áp dụng vào trong công nghiệp (Santana và cộng sự, 2006).
Phương pháp CO2 siêu tới hạn là một trong những công nghệ sạch và thân thiện với môi trường mới nhất đối với việc chế biến các sản phẩm thực phẩm và dược phẩm (Santana và cộng sự, 2006). Phương pháp này đã được Siti Machmudah và cộng sự thực hiện để chiết chlorogenic acid và cafein trong cà phê xanh. Các thí nghiệm đã được khảo sát trong các thiết bị chiết liên tục với tỷ lệ cà phê nhân và nước khác nhau, các tác giả đã thu được chlorogenic acid có lẫn cafein (Siti Machmudah, 2008).
Nghiên cứu sử dụng phương pháp tách chiết CO2 siêu tới hạn cũng được Carmen Mihaela Topala đề cập đến để tách các hợp chất tự nhiên có trong cà phê xanh. Nghiên cứu chứng minh rằng phương pháp này tách chiết các hợp chất tự nhiên có hiệu suất cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung môi thông thường. Do CO2 là một dung môi xanh, không cháy, có tính tương đối, độc tính thấp (Carmen M. Topala, 2015).
Quá trình tinh sạch nhằm mục đích nâng cao hàm lượng chlorogenic acid. Ở quy mô phòng thí nghiệm, các tác giả đã tiến hành các phương pháp tinh sạch axit Chlorogenic trong nhân cà phê xanh như sau:
Phương pháp 1: sử dụng muối (NH4)2SO4 để loại protein, sau đó dùng petroleum ether để loại lipid và các chất màu, dịch chiết tiếp tục được xử lý CHCl3 để loại caffeine và sáp. CGA được xử lý với ethyl acetate và làm khan bằng Na2SO4 sau đó lọc qua giấy lọc và cô đặc.
Phương pháp 2: dịch chiết được lọc qua giấy lọc 0,2µm, rồi lọc gel C18 Sep-Pak 51910, giải hấp bằng methanol 70%.
Dịch chiết CGA từ cà phê xanh được chiết bằng nước nóng 80oC, methanol 70%, ispropanol 60% cũng tiến hành tinh sạch với than hoạt tính và theo phương pháp của Rakotomalala cho thấy không có sự khác biệt nhiều giữa hai phương pháp tinh sạch, hàm lượng CGA trong dịch chiết đạt từ 4,67 – 5,87% chất khô.
Một số phương pháp tinh sạch chlorogenic acid đã được nghiên cứu và đăng ký bằng sáng chế. Tác giả Patent CN 103232346 A dùng ethanol 75 - 85% để tách chiết chlorogenic acid từ quả cà phê xanh sau đó ly tâm, siêu lọc tách các chất có khối lượng phân tử lớn. Dịch chứa chlorogenic acid sau đó được cô đặc, làm sạch trên nhựa D-140. Với quy trình này khoảng 70% tổng lượng chlorogenic acid trong nguyên liệu được tách chiết.
Tác giả Patent CN 103497106 A dùng 0,1% sodium sulfite tách chlorogenic acid từ quả cà phê xanh. Dịch chiết sau đó được loại caffein bằng nhựa XAD-16 macroporous sau đó thu chlorogenic acid bằng hấp thụ trên nhựa LX-28 macroporous, dịch làm sạch sau đó được tẩy màu bằng than hoạt tính và kết tinh để thu chế phẩm có độ tinh khiết 90%.
Trong chế biến cà phê, quá trình tách chiết các chất hòa tan có trong cà phê gặp trở ngại do hai thành phần pectin và cellulose chiếm chủ yếu trong quả cà phê gây ra. Hai thành phần này là hai thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có cấu trúc sinh học khá bền vững và chúng vốn là lớp che chở tế bào và chất liên kết tế bào khi quả cà phê còn sống (R. J. Clarke, 1987). Nhận thấy cấu trúc này khi ở trạng thái mất nước càng trở nên bền vững, chúng chỉ có thể bị phá hủy khi dùng các tác nhân axit, bazơ mạnh mà những tác nhân này không được khuyến khích trong chế
biến thực phẩm ngày nay (R. J. Clarke, 1987). Để giải quyết vấn đề này, nhận thấy có thể ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính enzyme pectinase và cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất pectin và cellulose. Ngày nay việc hướng đến sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong chế biến là hướng đi mới, hiệu quả vì nâng cao chất lượng sản phẩm và đồng thời tăng khả năng chiết các chất hòa tan (Lê Hồng Phú và cộng sự, 2008).
Các thử nghiệm để tách chiết CGA từ cà phê xanh cũng đã được nghiên cứu ở Việt Nam. Trần Phương Thảo (2019) khi nghiên cứu tách chiết CGA từ cà phê Robusta đã sử dụng phương pháp chiết ngâm và kết quả thu được 5,31%CGA/g chất khô. Trong cùng nghiên cứu đó, ở phương pháp chiết sử dụng vi sóng, thu được 5,17%CGA/g chất khô.
Một nghiên cứu khác về CGA tại Việt Nam là nghiên cứu thu nhận CGA từ cây Kim ngân hoa làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Kết quả sau khi bỏ tạp chất thu được lượng CGA là 19,66% (Lê Thị Thu Hiền, 2010).
Hiện nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về tách chiết và tinh sạch CGA còn khá hạn chế. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của pectinase trong tách chiết các hợp chất tự nhiên và sản xuất đồ uống lại khá phong phú.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được điều kiện tối ưu để thu nhận CGA trong quả cà phê xanh.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định điều kiện thích hợp thu nhận CGA trong quả cà phê xanh: + Tỷ lệ cơ chất - dung môi
+ pH dung dịch đệm + Nồng độ enzyme + Nhiệt độ thuỷ phân + Tốc độ khuấy
+ Thời gian thuỷ phân
- Tối ưu hóa quy trình chiết xuất CGA từ quả cà phê xanh.
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính chống oxy hóa của CGA - Xác định điều kiện sấy chân không thu nhận CGA dạng bột
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Quả cà phê xanh Arabica (Coffea Arabica) được thu hái vào tháng 8 năm 2019 ở huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai.
Vật liệu nghiên cứu: Cà phê xanh nguyên quả được rửa sạch, sấy ở 50oC tới độ ẩm 15% sau đó nghiền tới kích thước 1 – 2mm.
Chủng Aspergillus niger CF5 từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm Nghiệp.
2.3.2. Hoá chất và thiết bị
Hóa chất: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm có độ tinh sạch và chất lượng cao từ các hãng uy tín: chất chuẩn CGA 95% (Sigma Aldrich), ethanol 95%, acid sunfuric đặc (>99%), (NH4)2SO4, 3,5 – Dinitrosalisilic…
Thiết bị: Trong quá trình thí nghiệm, một số trang thiết bị và máy móc đã được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp như: cân phân tích, máy đo pH, tủ hút hóa chất, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vi sinh vật vô trùng, máy đo quang phổ, máy vortex, máy lắc ổn nhiệt. Ngoài ra còn sử dụng các dụng cụ cần thiết như ống eppendorf, pipetman, bình tam giác, bình trụ, nhiệt kế…
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Quả cà phê sau khi được thu hái sẽ được loại bỏ tạp chất, rửa sạch sau đó đem sấy khô và nghiền bột.
2.4.1. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA
Bản chất của quá trình tách chiết là sự chiết rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một dung môi nhờ quá trình khuếch tán các chất giữa các môi trường có nồng độ khác nhau. Hiệu quả của quá trình trích ly phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
CGA được tách chiết từ quả cà phê xanh theo phương pháp của Belay và cộng sự (2009) có thay đổi một số điều kiện nghiên cứu. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết CGA bao gồm: tỷ lệ cơ chất – dung môi; nồng độ enzyme; độ pH; nhiệt độ thuỷ phân; tốc độ lắc và thời gian thuỷ phân.
Toàn bộ thí nghiệm nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase thu nhận bằng phương pháp nuôi cấy chủng Aspergillus niger CF5 trên môi trường cám trấu (Nguyễn Việt Phương và cộng sự, 2019).
2.4.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết xuất CGA
Để xác định tỷ lệ cơ chất- dung môi thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền, bổ sung đệm phosphate pH 5,0 theo các tỉ lệ 1 : 10, 1 : 20, 1 : 30, 1 : 40, 1 : 50, 1 : 60, 1 : 70, 1 : 80, bổ sung enzyme tỷ lệ 20 U/g, thuỷ phân ở 40oC trong 60 phút với tốc độ lắc 50 vòng/phút. Gia nhiệt hỗn hợp tới 100oC trong 5 phút sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No1. Xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp đo mật độ quang của dung dịch tại OD324nm. Bố trí thí nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết CGA
TT Tỉ lệ cơ chất : dung môi (g/ml) Hàm lượng CGA (mg/g)
1 1 : 10 2 1 : 20 3 1 : 30 4 1 : 40 5 1 : 50 6 1 : 60 7 1 : 70 8 1 : 80
2.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA
Để xác định nồng độ enzyme thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền, bổ sung enzyme với nồng độ thay đổi từ 0 U/g, 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, đệm phosphate pH 5,0, tỉ lệ cơ chất – dung môi nghiên cứu thích hợp, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Gia nhiệt hỗn hợp tới 100oC trong 5 phút sau đó thu dịch lọc. Sản phẩm sau quá trình thủy phân được sắc ký bản mỏng và xác định hàm lượng chlorogenic acid có trong dung dịch, kết quả được bố trí theo bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA.
TT Nồng độ enzyme (U) Hàm lượng CGA (mg/g)
1 0 2 10 3 20 4 30 5 40 6 50 7 60
2.4.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA
Để xác định độ pH của dung môi thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền, bổ sung đệm phosphate với pH thay đổi từ 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme nghiên cứu thích hợp, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Dừng phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp tới 100oC trong 5 phút. Sản phẩm sau quá trình thủy phân được sắc ký bản mỏng để định tính sự có mặt của CGA. Xác định hàm lượng chlorogenic acid, thí nghiệm bố trí theo bảng 2.3.
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA
TT pH Hàm lượng CGA (mg/g) 1 5,0 2 5,5 3 6,0 4 6,5 5 7,0 6 7,5
2.4.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA
Để xác định nhiệt độ thuỷ phân thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền, thuỷ phân ở các nhiệt độ khác nhau từ 20, 30, 40, 50 , 60oC. Bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích hợp; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme nghiên cứu thích hợp, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Dừng phản ứng, thu dịch lọc sau đó định tính CGA bằng sắc ký bản mỏng. Xác định hàm lượng chlorogenic acid trong dịch thủy phân và bố trí thí nghiệm theo bảng 2.4.
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA
TT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng CGA (mg/g)
1 20
2 30
3 40
4 50
5 60
2.4.1.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA.
Để xác định tốc độ lắc thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích hợp; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme, nhiệt độ nghiên cứu thích hợp, thời gian 60 phút, tốc độ lắc thay đổi từ 0, 40, 80, 120, 160 vòng/phút. Dừng phản ứng và thu dịch lọc. Định tính CGA trong dịch chiết bằng sắc ký bản mỏng và xác định hàm lượng chlorogenic acid trong thí nghiệm theo bảng 2.5.
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA
TT Tốc độ lắc (vòng/phút) Hàm lượng CGA (mg/g) 1 0 2 40 3 80 4 120 5 160
2.4.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA Để xác định thời gian thuỷ phân thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà phê xanh nghiền bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích hợp; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme, nhiệt độ, tốc độ lắc nghiên cứu thích hợp, thời gian thuỷ phân thay đổi từ 10, 30, 60, 90, 120 phút. Gia
nhiệt hỗn hợp đến 100oC trong 5 phút, thu dịch lọc và định tính CGA. Hàm lượng chlorogenic acid trong dịch thủy phân được xác định và bố trí thí nghiệm theo bảng 2.6.
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA
TT Thời gian (phút) Hàm lượng CGA (mg/g)
1 10 2 30 3 60 4 90 5 120 2.4.1.7. Phương pháp định tính CGA bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
CGA được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) theo phương pháp của Mirna và cộng sự (2013).
Nguyên tắc
TLC là phương pháp sắc ký tách hỗn hợp chất bằng cách cho pha động di chuyển qua pha tĩnh. Pha động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp thụ. Tại đây, chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp thụ nhờ tính có cực của chúng. Do sự tương tác này mà chất phân tích sẽ chuyển động chậm hơn trong hệ thống sắc ký. Chất phân tích có ái lực yếu