Số liệu thí nghiệm được thu thập sau 3 lần lặp lại trên mỗi thí nghiệm, xử lý bằng phần mềm Excel và Design Expert 11.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Xử lý nguyên liệu
Quả cà phê sau khi thu hái được loại bỏ tạp chất, rửa sạch dưới nước máy, tiến hành sấy ở nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15% sau đó nghiền nhỏ tới kích thước 1 – 2mm và bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC).
Hình 3.1. Quả cà phê xanh sau khi xử lý (A), sấy (B), nghiền và rây (C)
Xây dựng đường chuẩn CGA
Xây dựng đường chuẩn CGA với chất chuẩn CGA của Sigma Aldrich tại các nồng độ từ 0,4 – 1,0 mg/ ml thu được kết quả biểu diễn ở bảng 3.1 và hình 3.2.
Bảng 3.1. Giá trị nồng độ CGA đo ở bước sóng 324 nm
Ống ĐC Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 VCGA (ml) 0 0,4 0,6 0,8 1 VNước cất (ml) 1 0,6 0,4 0,2 0 OD324nm 0,335 0,569 0,702 0,825 0,942 A B C
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CGA
Đường chuẩn CGA được xác định là: Y = 0,6114x + 0,3322
R2 = 0,9975
3.1. Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA
3.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất : dung môi đến quá trình chiết CGA
Tỷ lệ cơ chất – dung môi ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân do tỷ lệ này ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán của chất cần chiết xuất vào dung môi. Tỷ lệ dung môi - nguyên liệu cao cho phép chiết xuất hoàn toàn chất chiết từ nguyên liệu nhưng dịch chiết thu được loãng, tốn chi chí để làm đặc dịch chiết. Ngược lại, tỷ lệ dung môi - nguyên liệu thấp dẫn đến hiệu suất quá trình chiết xuất không cao bởi lẽ quá trình này sẽ dừng lại khi đạt cân bằng nồng độ chất chiết trong nguyên liệu và dung môi. Lượng dung môi quá lớn hoặc quá nhỏ hơn so với lượng cơ chất cũng gây ảnh hưởng lớn tới hiệu suất của quá trình thuỷ phân. Do vậy, nghiên cứu tỷ lệ cơ chất – dung môi đến quá trình chiết xuất CGA được thực hiện với tỷ lệ 1 : 10 đến 1 : 80, kết quả thu được biển diễn trên hình 3.3.
Hình 3.3. Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ cơ chất – dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA
Qua đồ thị hình 3.3. cho thấy hiệu quả tách chiết CGA cao nhất đạt 34,38 mg/g khi thuỷ phân quả cà phê xanh với tỉ lệ 1 - 50 và giảm dần khi tăng tỉ lệ này lên 1 - 80 (hàm lượng CGA đạt 28,57 mg/g). Nguyên nhân có thể do đây là thí nghiệm đầu tiên nên các đơn yếu tố chưa tối ưu dẫn tới lượng CGA tách được còn giới hạn, tiếp tục tăng tỷ lệ cơ chất – dung môi với cùng điều kiện thuỷ phân cũng không khiến cho hàm lượng CGA tăng lên.
Hình 3.4. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tới quá trình chiết xuất CGA
CGA M: Marker 1. Tỷ lệ 1-10 2. Tỷ lệ 1-20 3. Tỷ lệ 1-30 4. Tỷ lệ 1-40 5. Tỷ lệ 1-50 6. Tỷ lệ 1-60 7. Tỷ lệ 1-70 8. Tỷ lệ 1-80
Theo kết quả sắc ký đồ hình 3.4, nhận thấy đường chạy của các mẫu thí nghiệm có xuất hiện vạch tương ứng vị trí của CGA chuẩn. Như vậy trong dung dịch thu được sau quá trình thủy phân có chứa CGA.
Trong các nghiên cứu về tách chiết hợp chất tự nhiên có trong thực vật, tỷ lệ cơ chất- dung môi cũng là một yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu suất của quá trình. Theo Vũ Kim Dung (2015), kết quả nghiên cứu các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS đã xác định tỷ lệ pectin- đệm citrate phosphate ở 3% cho kết quả cao nhất. Trong nghiên cứu về tách chiết polyphenol nhóm tanin từ vỏ keo lá tràm, tỷ lệ rắn:lỏng tối ưu là 2g: 70ml, tương ứng với 3,5% (Lê Tự Hải và cộng sự, 2011). Đỗ Biên Cương và các công sự (2010) trong nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic MOS đã đề cập đến sự quan trọng của lượng cơ chất trong dung môi, tỷ lệ bã cơm dừa 10% (w/v) được lựa chọn để thực hiện tiếp nghiên cứu.
Theo kết quả thu được ở hình 3.3, lựa chọn tỷ lệ 1-50 cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA
Lựa chọn nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả chiết xuất cao nhất đồng thời để chi phí sản xuất được hợp lý nhất.
Thí nghiệm được tiến hành với enzyme bổ sung thay đổi theo tỷ lệ nồng độ từ 0 U/g, 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, pH 5,0, tỉ lệ cơ chất – dung môi 1 – 50, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị 3.5.
Kết quả hình 3.5 cho thấy hàm lượng CGA thu được trong các thí nghiệm sử dụng enzyme cao hơn so với khi không sử dụng (thí nghiệm 0U/g thu được 32,63mg/g). Khi nồng độ tăng từ 20 U/g – 40 U/g, hàm lượng CGA trong dịch thuỷ phân ngày càng tăng lên, đạt cực đại tại 40 U/g (44,642 mg/g).
Hình 3.6. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình chiết xuất CGA
Kết quả sắc ký đồ hình 3.6. cho thấy rõ ràng tại đường chạy số 4, số 5 và số 6 cho hình ảnh vết màu tạo ra các vệt nâu nằm trên đường chạy có thể do thí nghiệm thuỷ phân cho sản phẩm vẫn nâu đậm nét hơn so với các đường chạy còn lại.
Tỷ lệ enzyme- cơ chất là một yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng lớn tới quá trình thủy phân. Do đó mà trong những nghiên cứu về điều kiện tách chiết các hợp chất, thí nghiệm về nồng độ enzyme luôn được tiến hành thực hiện. Trong nghiên cứu tạo MOS từ bã cơm dừa, nồng độ enzyme endo-β-1,4- mannanase được thử nghiệm với tỷ lệ từ 25-50 U/g, kết quả nồng độ enzyme cho hiệu quả sử dụng cao nhất là 40U/g (Đỗ Biên Cương, 2010). Nghiên cứu của Nguyễn Hồng Ly (2014) về điều kiện chuyển hóa pectin tạo POS cho thấy, trong thí nghiệm về nồng độ enzyme, khi sử dụng Endo- polygalacturonase ở nồng độ thấp (20-30U/g) thì hiệu quả tách chiết không cao. Nồng độ enzyme quá cao (50-60U/g) lại cho ra các sản phẩm không mong muốn. M: Marker 1. Nồng độ 0U/g 2. Nồng độ 10 U/g 3. Nồng độ 20 U/g 4. Nồng độ 30 U/g 5. Nồng độ 40 U/g 6. Nồng độ 50 U/g 7. Nồng độ 60 U/g CGA
Dựa vào kết quả hình 3.5, lựa chọn nồng độ enzyme 40 U/g để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA
Mỗi enzyme đều có khoảng pH tối ưu khác nhau mà tại đó hoạt tính enzyme đạt cao nhất. Dung dịch đệm chiếm phần thể tích lớn trong dịch thuỷ phân, ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme vì vậy cũng ảnh hưởng rất lớn tới kết quả quá trình thuỷ phân. Trong quá trình thủy phân cà phê, enzyme chịu tác động từ nhiệt độ và thời gian, pH dịch thủy phân thay đổi, khuấy trộn cơ học.
Không chỉ ảnh hưởng tới enzyme, pH còn gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Vì vậy mỗi loại nguyên liệu lại phù hợp với một độ pH nhất định. Trong quá trình chiết xuất một số thành phần không mong muốn có thể tan theo dịch chiết, các glycoside cũng có thể bị thuỷ phân khi sử dụng dung môi có độ pH thấp. Thông thường dựa trên một số tiêu chí như: khả năng hoà tan chất cần tách chiết, tính hoà tan của sản phẩm mong muốn… để lựa chọn dung môi với độ pH phù hợp cho quá trình chiết xuất. Vì vậy, nghiên cứu xác định pH tối ưu cho quá trình thủy phân cà phê xanh thu nhận CGA là hết sức cần thiết.
Nghiên cứu xác định pH của dung dịch đệm được thực hiện tại pH 5 đến pH 7,5 cho kết quả được biểu diễn theo hình 3.7.
Hình 3.7. Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA
Đồ thị hình 3.7. cho thấy hàm lượng CGA thu được từ quả cà phê xanh cao nhất tại điều kiện pH 5,5 (51,69 mg/g) sau đó giảm dần tại pH 7,5 (40,66 mg/g). Các nghiên cứu liên quan tới enzyme pectinase cho thấy enzyme này hoạt động mạnh tại pH từ 4,5 – 5,5 tuỳ từng loại cơ chất đem thuỷ phân.
Hình 3.8. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết xuất CGA
Nghiên cứu của D.R. Kashyap và P.K. Vohra (2001) cho thấy pectinase từ Aspergillus niger hoạt động từ pH 4,5 – 6. Do vậy pH = 5,5 sử dụng để thuỷ phân pectin trong quả cà phê xanh nhằm thu nhận CGA nằm trong khoảng hoạt động tối ưu của enzyme này. Qua kết quả trên có thể lựa chọn điều kiện pH 5,5 để tiếp tục tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA
Nhiệt độ trích ly làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình trích ly do làm tăng hệ số khuếch tán chất chiết và giảm độ nhớt dung môi, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao sẽ gây ra những bất lợi như: phá hủy các glycoside, thúc đẩy sự oxy hóa và epimer hóa các polyphenol, tăng chiết các chất khác gây khó khăn cho việc tinh chế. Nhiệt độ quá thấp thường làm giảm hiệu quả của quá trình trích ly. Vì vậy, trong nghiên cứu tách chiết cần xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá
CGA M: Marker 1. pH= 5,0 2. pH= 5,5 3. pH= 6,0 4. pH= 6,5 5. pH= 7,0 6. pH= 7,5
trình tách chiết sao cho không quá cao để tránh sự oxy hóa dịch chiết nhưng cũng không quá thấp gây giảm hiệu quả quá trình chiết.
Nhiệt độ là yếu tố cốt yếu ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân. Hầu hết mọi quá trình thuỷ phân với mọi cơ chất đều phải có sự gia nhiệt kể cả không sử dụng enzyme. Nhiệt độ tác động tới bề mặt và cấu tạo cơ chất, giúp dung môi hoạt động tốt và dễ dàng phân cắt cơ chất hơn. Do vậy, thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh được thực hiện với nhiệt độ 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC. Kết quả thí nghiệm được thể hiện tại đồ thị 3.9.
Hình 3.9. Đồ thị mốiquan hệ của nhiệt độ và hàm lượng
chiết xuất CGA
Kết quả cho thấy hàm lượng CGA ít thay đổi. Khi nhiệt độ thay đổi từ 20oC – 60oC, hàm lượng CGA thu được từ 32,49 – 53,82 mg/g. Đạt cao nhất tại nhiệt độ 50oC (53,82 mg/g). Hàm lượng CGA thu được thấp nhất tại nhiệt độ 20oC (32,49 mg/g) do nhiệt độ thấp làm enzyme hoạt động không hiệu quả nên hiệu suất quá trình thuỷ phân thấp.
Nghiên cứu của Agnan M. Combo và Mario Aguedo (2012) cho thấy pectinase từ Aspergillus niger có phổ hoạt động tối ưu từ 40 – 60oC. Theo kết quả ở thí nghiệm trên, mức nhiệt đem lại hiệu quả cao nhất cho quá trình chiết xuất CGA là 50oC vẫn nằm trong khoảng nhiệt độ hoạt động tối ưu của pectinase.
Hình 3.10. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết CGA
Các đường chạy của các mẫu thí nghiệm đều xuất hiện vạch tương ứng vị trí của CGA chuẩn cho thấy sản phẩm dịch thuỷ phân đã tách được CGA từ quả cà phê xanh. Dựa vào kết quả tại đồ thị hình 3.9 và sắc ký đồ hình 3.10, chọn điều kiện nhiệt độ 50oC để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.5. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA
Việc đảo trộn hỗn hợp bằng thiết bị lắc sẽ giúp cho dung môi và enzyme khuyếch tán đều vào cơ chất đồng thời tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với dung môi làm tăng hiệu quả hoạt động của các đơn yếu tố, từ đó tăng hiệu suất thuỷ phân chung. Tuy nhiên nếu tốc độ lắc quá cao có thể làm vỡ cấu trúc của enzyme và ảnh hưởng liên kết giữa cơ chất với dung môi, cũng làm giảm khả năng phân cắt cơ chất. Vì vậy tốc độ lắc cũng là một điều kiện cần phải xác định trong quá trình thuỷ phân. Thí nghiệm xác định tốc độ lắc thực hiện với các tốc độ 0, 40, 80, 120, 160 vòng/phút cho kết quả được biểu diễn ở đồ thị hình 3.11. M: Marker 1. Nhiệt độ 20oC 2. Nhiệt độ 30oC 3. Nhiệt độ 40oC 4. Nhiệt độ 50oC 5. Nhiệt độ 60oC CGA
Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA
Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình chiết xuất CGA
Kết quả phân tích cho thấy tại tốc độ lắc 80 vòng/phút thu được hàm lượng CGA cực đại là 58,25 mg/g. Tại tốc độ lắc 40 vòng/phút thu được là 53,19 mg/g, tại tốc độ lắc 120 vòng/phút thu được là 51,38 mg/g. Có thể thấy sự chênh lệch hàm lượng CGA tại 80 vòng/phút so với các tốc độ khác là rất lớn.
CGA M: Marker 1. 0 vòng/phút 2. 40 vòng/phút 3. 80 vòng/phút 4. 120 vòng/phút 5. 160 vòng/phút
Theo một số nghiên cứu, tốc độ lắc nhiều hay ít phụ thuộc vào độ nhớt của dung dịch. Với nghiên cứu có cơ chất là pectine, độ nhớt của dung dịch này là rất lớn nên tốc độ lắc cao, dao động trong khoảng 100-500 vòng/phút tùy thuộc nồng độ cơ chất (Vũ Kim Dung, 2015). Trong thí nghiệm này, cơ chất là bột cà phê có lượng pectine không cao nên độ nhớt của dung dịch thấp, vì vậy tốc độ lắc chọn để nghiên cứu tương đối thấp.
Như vậy chọn tốc độ lắc 80 vòng/phút là để tiếp tục thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA
Cùng với các yếu tố trên thì thời gian chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và chất lượng của dịch chiết. Hiệu quả trích ly thường tăng theo thời gian trích ly. Thời gian ngắn thì hàm lượng polyphenol thu được thấp. Tuy nhiên, thời gian dài quá dễ gây oxy hóa polyphenol tạo ra sản phẩm không mong muốn làm giảm chất lượng của dịch chiết, giảm lượng các hợp chất polyphenol thu được, tốn năng lượng và làm giảm hiệu suất sử dụng của thiết bị.
Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất CGA
Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tới quá trình chiết xuất CGA
Kết quả tại đồ thị hình 3.13 và sắc ký đồ hình 3.14 cho thấy hàm lượng CGA cực đại thu được là 58,18 mg/g không thay đổi nhiều so với thí nghiệm trước đó (58,25 ± 1,0 mg/g). Kết quả này có thể do CGA trong mẫu cà phê xanh đã được trích ly hết. Chọn thời gian thích hợp cho phản ứng thuỷ phân quả cà phê xanh thu nhận CGA là 60 phút.
Trong thí nghiệm của Lê Tự Hải (2011) về ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết tách tanin, nhận thấy lượng tanin tách được càng nhiều khi tăng thời gian thực hiện phản ứng từ 30 lên 75 phút và giá trị lúc này đạt mức ổn định. Nghiên cứu của Đỗ Biên Cương về sử dụng bã cơm dừa tạo prebiotic cũng cho thấy thời gian là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình chuyển hóa.
3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA
Nghiên cứu tách chiết có thể thực hiện bằng cách sử dụng đơn yếu tố - one factor at a time approach (Chirinos và cộng sự, 2007; Kossah và cộng sự, 2010) hoặc dùng phương pháp bề mặt đáp ứng Response Surface Methodology (RSM) (Kiassos và cộng sự, 2009; Pompeu và cộng sự, 2009; Silva và cộng sự, 2007). M: Marker 1. 10 phút 2. 30 phút 3. 60 phút 4. 90 phút 5. 120 phút