HPLC
Kết quả xây dựng đường chuẩn CGA.
Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ
Nồng độ CGA (µl/ml) 10 20 50 100 200
Diện tích peak 1367,5 1387,5 1565,5 1726,6 2248,9 M: Marker
1. Mẫu trước tối ưu 2. Mẫu sau tối ưu
Hình 3.18. Đồ thị đường chuẩn CGA
Đường chuẩn CGA xác định được là: Y = 4,6287x + 1307.4 R2 = 0,9938
Kết quả xác định hàm lượng CGA trong dịch thủy phân bằng phương pháp HPLC
Hình 3.19. Sắc ký đồ của chất chuẩn CGA
Hình 3.20. Sắc ký đồ của mẫu thử CGA
Kết quả sắc ký đồ tại hình 3.20 cho thấy chất chuẩn sử dụng là 5-CGA phân tích trong 29 phút, CGA xuất hiện ở phút thứ 3, thời gian lưu trong
khoảng hơn 1 phút. So sánh với kết quả của mẫu thử hình 3.21, nhận thấy có sự trùng khớp khi ở phút thứ 3 cũng có đường sắc ký hiện lên và lưu lại đến qua phút thứ 4. Điều này chỉ ra rằng, trong mẫu thử tồn tại phân tử có cấu tạo giống với mẫu chuẩn.
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC
TN
Hàm lượng CGA (mg/g) Máy đo quang phổ
(324nm) Hệ thống HPLC 1 37,44 35,07 2 63,81 61,40 3 58,25 56,19 4 61,83 59,03
Chú thích: TN1- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 3 trong ma trận thực nghiệm Box-Behnken; TN2- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 13 trong ma trận thực nghiệm Box- Behnken; TN3- Dịch thủy phân trước khi tối ưu; TN4- Dịch thủy phân sau khi tối ưu.
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy hàm lượng CGA trong dịch thủy phân xác định bằng phương pháp HPLC cho kết quả thấp hơn phương pháp đo bằng máy quang phổ. Điều này tương tự với kết quả của Abebe Belay và A.V.Gholap (2009) khi nghiên cứu cho thấy rằng lượng CGA thu được khi đo bằng máy quang phổ là (6,05-6,25%) cao hơn so với phương pháp đo bằng HPLC (5,6 – 6,1%).
3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa
3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn
Nghiên cứu ảnh hưởng của CGA đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn có lợi được thực hiện trên Bacillus clausii và vi khuẩn gây hại E. coli
trong môi trường chứa glucose hoặc CGA 1% (w/v). Kết quả thu được biểu diễn ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi khuẩn gây hại.
STT Chủng thử nghiệm
Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi (Tính theo LgCFU/ml) Môi trường + 1% Glucose Môi trường + 1% CGA 1 Lactobacillus acidophilus ATCC4356 7,88 ± 0,08 8,16 ±0,09 2 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,72 ± 0,09 6,85 ± 0,08 3 Lactobacillus plantarum 299V 7,02 ± 0,09 7,18 ± 0,08 4 Lactobacillus bulgaricus CH-3 6,57 ± 0,08 6,63 ± 0,09
5 Lactobacillus casei Shirota 7,14 ± 0,09 7,28 ± 0,09
6 Bacillus clausii 7,08 ± 0,09 7,13 ± 0,08
7 Escherichia. Coli 9,23 ± 0,09 7,31 ± 0,08
8 Staphylococcus aureus ATCC 25923
7,91 ± 0,09 6,58 ± 0,09 Kết quả bảng 3.7 cho thấy CGA gần như không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn probiotic. Sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng chứa 1% CGA, số lượng khuẩn lạc không khác biệt nhiều so với khi nuôi trong môi trường lỏng chứa 1% glucose.
Ngược lại, đối với các chủng vi khuẩn có hại như E.coli hay S.aureus,
CGA thể hiện khả năng ức chế nhẹ đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Mật độ vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trong môi trường chứa 1%CGA giảm hơn so với khi nuôi ở môi trường đối chứng chứa 1% glucose.
Theo nghiên cứu của Bajko và cộng sự (2016), CGA có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn gây hại. Khả năng kháng các vi sinh vật probiotic của CGA cũng được nghiên cứu, kết quả cho thấy rằng CGA không kìm hãm sự phát triển của các lợi khuẩn khi nồng độ đạt đến 10mg/ml.
3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính oxy hóa
Dịch chiết CGA sau khi cô đặc 20 lần bằng cô chân không được đem đi xác định hoạt tính chống oxy hóa tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa
Mẫu Khả năng trung hòa
gốc tự do (SC,%) SC50 (µg/ml) Chứng (+) [ascorbic acid] 86,53 ± 0,30 12,6 µg/ml
Chứng (-)
[DPPH/EtOH+DMSO] 0,0 ±0,0 -
CGA tách chiết 26,31 ± 0,90 ≥ 1000 µg/ml
Theo kết quả ở trên, nhận thấy mẫu CGA tách chiết chưa biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa khử khi thử nghiệm bằng phương pháp DPPH tới nồng độ thử nghiệm là 1000µg/ml.
3.4. Kết quả quá trình sấy chân không
Sấy chân không là phương pháp sấy ở môi trường áp suất cực thấp, gần như là chân không. Trong môi trường này, nước sẽ sôi ở nhiệt độ thấp hơn rất nhiều so với nhiệt độ sôi thông thường. Khi nước sôi, các phân tử nước hoạt động mạnh nhất đồng nghĩa với sự bốc hơi diễn ra nhanh nhất sẽ làm tăng tốc độ sấy lên nhiều lần so với sấy khô thông thường.
Sấy chân không có nhiều ưu điểm như giữ nguyên được màu sắc, hương vị, chất dinh dưỡng cũng như các tính chất đặc trưng của sản phẩm, hầu như không làm biến đổi tính chất vật lý, hóa học của vật sấy, sản phẩm được sấy chân không có độ ẩm rất thấp (khoảng 1 - 3%) nên bảo quản được lâu hơn.
Vì sản phẩm là chế phẩm CGA hướng tới cho mục đích phục vụ sức khỏe nên sấy chân không là phương pháp lựa chọn thích hợp. Nhiệt độ sấy rất
quan trọng vì vậy thí nghiệm này chúng tôi khảo sát điều kiện nhiệt độ sấy dịch chiết cô đặc để thu được sản phẩm chứa CGA có hàm lượng cao.
Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không thu nhận chế phẩm CGA cho kết quả được biểu diễn tại bảng 3.9.
Bảng 3.9. Nhiệt độ và thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA
Chế độ sấy mẫu Nhiệt độ sấy (oC) Thời gian sấy (giờ) Độ ẩm (%)
Khối lượng mẫu thu được (g) Hàm lượng CGA (mg/g) Chân không 50 13 6,9 9,15 43,21 ± 1,45 60 10 6,52 9,34 43,51 ±1,82 70 8 4,19 9,61 46,01 ± 1,32
Ở chế độ sấy chân không, nhiệt độ 50 và 60oC độ ẩm của sản phẩm thu được chỉ đạt trên 6,5%, hàm lượng chế phẩm chứa CGA đạt 43,21 ± 1,45 mg/g và 43,51 ±1,82 mg/g, thời gian sấy từ 10 - 13 giờ. Ở 70oC, sau 8 giờ sản phẩm đã đạt độ ẩm theo yêu cầu (4,41 – 5%), khối lượng mẫu thu được là 9,61g và hàm lượng của CGA cũng vượt hơn hẳn so với sấy ở nhiệt độ thấp (46,01 ± 1,32 mg/g).
Vì vậy chọn nhiệt độ sấy ở 70oC để sấy tạo sản phẩm CGA. Trong điều kiện sấy chân không, chế phẩm thu hồi có độ xốp mịn, màu xanh vàng sáng đẹp, dễ dàng thu hồi chế phẩm.
Sơ đồ thu nhận CGA từ quả cà phê xanh
Sau khi tiến hành nghiên cứu các điều kiện thủy phân quả cà phê xanh, chúng tôi đã đưa ra quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm CGA bằng
pectinase như hình 3.22 sau.
Hình 3.22. Quy trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh.
Quy trình cụ thể như sau:
Bước 1: Xử lý nguyên liệu
Xử lý
(Sấy khô, nghiền bột) Quả cà phê xanh
Chiết CGA
(Tỷ lệ cơ chất- dung môi 1 – 60, pH 5,5; nồng độ
enzyme 44 U/g, 50oC, 80 vòng/phút, 55 phút)
Lọc
Sấy chân không (70oC, 8 giờ)
Cô đặc
(Cô chân không 20 lần, 50oC)
Quả cà phê sau khi thu hái được loại bỏ tạp chất, rửa sạch với nước rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15%. Nghiền nhỏ cà phê thành bột mịn và bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC).
Bước 2: Chiết CGA từ cà phê xanh bằng pectinase
Bột cà phê được hòa vào dung dịch đệm phosphate pH 5,5 có bổ sung 44U/g pectinase. Đem ủ hỗn hợp trong tủ lắc ở nhiệt độ 50oC với tốc độ lắc 80 vòng/phút. Sau 55 phút, dừng phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 100oC trong 5 phút.
Bước 3: Thu nhận dịch và cô đặc
Hỗn hợp dịch sau thủy phân được lọc bỏ bã, thu dịch CGA thô rồi tiến hành cô đặc 20 lần bằng phương pháp cô quay chân không ở 50C.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Sau thời gian nghiên cứu, luận văn đưa ra được một số kết luận sau: 1. Kết quả nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh:
- Tỷ lệ cơ chất – dung môi: 1 – 50 - pH dung dịch đệm: 5,5
- Nồng độ enzyme: 40 U/g - Nhiệt độ: 50oC
- Tốc độ lắc: 80 vòng/phút - Thời gian: 60 phút
2. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất CGA trong cà phê xanh bằng phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken. Với tỷ lệ cơ chất – dung môi: 1 – 60, nồng độ enzyme 44 U/g trong thời gian 55 phút, hàm lượng CGA thu được là 62,3077 mg/g.
3. Xác định được dịch chiết CGA khi sử dụng với nồng độ 1% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu với chủng vi khuẩn E.coli nhưng không gây ức chế đến lợi khuẩn Bacillus clausii.
4. Điều kiện sấy chân không thích hợp là: nhiệt độ 70oC, 8 giờ cho sản phẩm đã đạt độ ẩm 4,41 – 5%, khối lượng mẫu thu được là 9,61g và hàm lượng của CGA đạt 46,01 mg/g.
2. Kiến nghị
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi tách chiết khác đối với tách chiết CGA.
- Chứng minh hoạt tính sinh học của CGA trên một số loại vi khuẩn khác. - Kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của CGA tách chiết ở các nồng độ cao hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Biên Cương, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010). Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic Mannooligosacharit bằng Endo-β-1,4-mannanase từ Aspergillus niger BK01. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 46(3): 43-49.
2. Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng, Đỗ Đại Nghĩa (2008). Nghiên cứu chế tạo chế phẩm Biocoffee-1 từ Aspergilus niger và ứng dụng lên men các loại cà phê. Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 12
3. Lê Thị Thu Hiền (2010). Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Lê Tự Hải, Nguyễn Thị Lan Anh, Lưu Vũ Diễm Hằng (2011). Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của hợp chất Polyphenol nhóm Tanin từ vỏ keo lá tràm. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng,
44(3): 142-149.
5. Nguyễn Hồng Ly (2014), Nghiên cứu chuyển hóa pectin tạo Pectic oligosaccharide (POS) bằng Endo-polygalacturonase và khảo sát một số hoạt tính sinh học. Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
6. Nguyễn Việt Phương và Vũ Kim Dung (2017). Tuyển chọn Aspergillus Niger sinh tổng hợp Pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh. Vietnam Biological Industries.
7. Trần Phương Thảo (2019). Chiết xuất cao chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh. Luận văn thạc sĩ ngành Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh.
8. Vũ Kim Dung (2015). Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase. Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Abebe Belay and A. V. Gholap (2009). Characterization and determination of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans by UV-VIS spectroscopy. African Journal of Pure and Applied Chemistry, 3(11): 234-240.
10. Ae-Sim Cho, Seon Min Jeon, Myun Joo Kim, Jiyong Yeo (2010). Chlorogenic acid exhibits anti obesity property and improves lipid metabolism in high fat diet induced obese mice. Food and Chemical Toxicology.
11. Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo (2012). Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations. Food and Bioproducts Processing, 90: 588-596.
12. Alonso-Salces, R. M., Serra, F., Reniero, F., Héberger. K (2009). Botanical and geographical characterization of green coffee (Coffea Arabica
and Coffea canephora): Chemometric evaluation of phenolic and methylxanthine contents. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57: 4224-235.
13. Alves. R. c., Almeida. I. M. c., Casal. s., Oliveira. M. B. (2010). Isoflavones in coffee: Influence of species, roast degree, and brewing method.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 3002-3007.
14. Attila Hunyadi, Ana Martins, Tusty-Jiuan (2012). Chlorogenic Acid and Rutin Play a Major Role in the InVivo Anti-Diabetic Activity of Morus alba Leaf Extract on Type II Diabetic Rats. PLOS ONE vol 7.
15. Barnes, H. M., Feldman, J. R.; White, W. V. (1950). Isochlorogenic Acid. Isolation from Coffee and Structure Studies. Journal of the American Chemical Society, 72: 4178-4182.
16. Belitz, H.-D., Grosch, w., & Schieberle (2009). Coffee, tea, cocoa. Food Chemistry, 4: 938-951.
17. Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E. and Berset C (1995). Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm.-Wiss. u.- Technol., 28: 25-30.
18. C.Campa et al (2005). Diversity in bean Caffeine content among wild Coffea species: Evidence of a discontinuous distribution. Food Chemistry, 91: 633-637.
19. Carlos Tello, PhD (2020). 6 Health Benefits of Chlorogenic Acid + Side Effects. Molecular Biology, pp: 20-26.
20. Carmen M. Topala, Lavinia D. Tataru, Targu d.Vale (2015). Infrared Spectra of Green Arabica Coffee Extraction using Supercritical Carbon Dioxide and Soxhlet Technique. Chemistry, pp: 1128-1131.
21. Clifford, M. N. (1999). Chlorogenic acids and other cinnamates – nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture, 79 (3), pp. 362–372.
22. Clifford, M. N. (2003). The analysis and characterization of chlorogenic acids and other cinnamates. Methods in Polyphenol Analysis, 14: 314–337 23. Coffee. Edited by R. J. Clarke and R. Macrae. Volume 1. Chemistry
(1985), pp. 306. Volume 2. Technology (1987), pp. 321
24. Corse, J., Lundin, R. E., Waiss, A. C. (1965). Identification of several components of isochlorogenic acid. Phytochemistry, 4: 527–529.
25. D.R. Kashyap, P.K. Vohra, S. Chopa, R. Tewari (2001). Applications of pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource Technology, 77: 215-227.
26. Deniz Bagdasa, Betul Cam Etoz, Zulfiye Gul (2015). In vivo systemic chlorogenic acid therapy under diabetic conditions: Wound healing effects and cytotoxicity/genotoxicity profile. Food and Chemical Toxicology. pp: 54- 61.
27. Elias Kiassos, Stefania Mylonaki, Dimitris P. Makris, Panagiotis Kefalas (2009). Implementation of response surface methodology to optimise extraction of onion (Allium cepa) solid waste phenolics. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 10(2): 246-252.
28. Ewelina Bajko, Monika Kalinowska, Piotr Borowski, Leszek S. (2016). 5-O-Caffeoylquinic acid: A spectroscopic study and biological screening for antimicrobial activity. LWT- Food Science and Technology, 65: 471-479. 29. Farah. A., Monteiro. M., Donangelo. c. M., Lafay (2008). Chlorogenic acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans. Journal of Nutrition, 138: 2309-2315.
30. Farah. A., de Paulis. T., Trugo. L. C., Martin. P. R (2005). Effect of roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(5): 1505-1513.
31. Hiroshi Shimoda, Emi Seki, Michio Aitani (2006). Inhibitory effect of green coffee bean extract on fat accumulation and body weight gain in mice.
BMC Complementary and Alternative Medicine, 9.
32. Igho Onakpoya, Rohini Terry, and Edzard Ernst (2011). The Use of Green Coffee Extract as a Weight Loss Supplement: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomised Clinical Trials. Volume 2011, Article ID 382852.
33. Iwai. K., Kishimoto. N., Kakino. Y., Mochida. K., Fujita. T (2004). In vitro antioxidative effects and tyrosinase inhibitory activities of seven hydroxycinnamoyl derivatives in green coffee beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 4893 -4898.
34. Jalal, Mahbubul A. F., Read, David J., Haslam. E. (1982). Phenolic composition and its seasonal variation in Calluna vulgaris. Phytochemistry 21, p. 1397–1401.
35. Junghyun Kim, Il-Ha Jeong, Chan-Sik Kim, Yun Mi Le (2011). Chlorogenic acid inhibits the formation of advanced glycation end products and associated protein cross-linking. Archives of Pharmacal Research.
36. Kazuya Kozuma, Shigemi Tsuchiya, Jun Kohori (2005). Antihypertensive Effect of Green Coffee Bean Extract on Mildly Hypertensive Subjects. Hypertension Research.
37. Kumar, G.P., Navyaa, K., Ramya, E.M., Venkataramana, M., Anand, T., Anilakumar, K.R. (2013). DNA damage protecting and free radical scavenging properties of Terminalia arjuna bark in PC-12 cells and plasmid DNA. Free Rad. Antioxid, 3: 35-39
38. Kweon, Mee-Hyang; Hwang, Han-Joon; Sung, Ha-Chin (2001). Identification and Antioxidant Activity of Novel Chlorogenic Acid Derivatives from Bamboo (Phyllostachys edulis). Journal of Agricultural and