Việc đảo trộn hỗn hợp bằng thiết bị lắc sẽ giúp cho dung môi và enzyme khuyếch tán đều vào cơ chất đồng thời tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với dung môi làm tăng hiệu quả hoạt động của các đơn yếu tố, từ đó tăng hiệu suất thuỷ phân chung. Tuy nhiên nếu tốc độ lắc quá cao có thể làm vỡ cấu trúc của enzyme và ảnh hưởng liên kết giữa cơ chất với dung môi, cũng làm giảm khả năng phân cắt cơ chất. Vì vậy tốc độ lắc cũng là một điều kiện cần phải xác định trong quá trình thuỷ phân. Thí nghiệm xác định tốc độ lắc thực hiện với các tốc độ 0, 40, 80, 120, 160 vòng/phút cho kết quả được biểu diễn ở đồ thị hình 3.11. M: Marker 1. Nhiệt độ 20oC 2. Nhiệt độ 30oC 3. Nhiệt độ 40oC 4. Nhiệt độ 50oC 5. Nhiệt độ 60oC CGA
Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA
Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình chiết xuất CGA
Kết quả phân tích cho thấy tại tốc độ lắc 80 vòng/phút thu được hàm lượng CGA cực đại là 58,25 mg/g. Tại tốc độ lắc 40 vòng/phút thu được là 53,19 mg/g, tại tốc độ lắc 120 vòng/phút thu được là 51,38 mg/g. Có thể thấy sự chênh lệch hàm lượng CGA tại 80 vòng/phút so với các tốc độ khác là rất lớn.
CGA M: Marker 1. 0 vòng/phút 2. 40 vòng/phút 3. 80 vòng/phút 4. 120 vòng/phút 5. 160 vòng/phút
Theo một số nghiên cứu, tốc độ lắc nhiều hay ít phụ thuộc vào độ nhớt của dung dịch. Với nghiên cứu có cơ chất là pectine, độ nhớt của dung dịch này là rất lớn nên tốc độ lắc cao, dao động trong khoảng 100-500 vòng/phút tùy thuộc nồng độ cơ chất (Vũ Kim Dung, 2015). Trong thí nghiệm này, cơ chất là bột cà phê có lượng pectine không cao nên độ nhớt của dung dịch thấp, vì vậy tốc độ lắc chọn để nghiên cứu tương đối thấp.
Như vậy chọn tốc độ lắc 80 vòng/phút là để tiếp tục thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA
Cùng với các yếu tố trên thì thời gian chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và chất lượng của dịch chiết. Hiệu quả trích ly thường tăng theo thời gian trích ly. Thời gian ngắn thì hàm lượng polyphenol thu được thấp. Tuy nhiên, thời gian dài quá dễ gây oxy hóa polyphenol tạo ra sản phẩm không mong muốn làm giảm chất lượng của dịch chiết, giảm lượng các hợp chất polyphenol thu được, tốn năng lượng và làm giảm hiệu suất sử dụng của thiết bị.
Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất CGA
Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tới quá trình chiết xuất CGA
Kết quả tại đồ thị hình 3.13 và sắc ký đồ hình 3.14 cho thấy hàm lượng CGA cực đại thu được là 58,18 mg/g không thay đổi nhiều so với thí nghiệm trước đó (58,25 ± 1,0 mg/g). Kết quả này có thể do CGA trong mẫu cà phê xanh đã được trích ly hết. Chọn thời gian thích hợp cho phản ứng thuỷ phân quả cà phê xanh thu nhận CGA là 60 phút.
Trong thí nghiệm của Lê Tự Hải (2011) về ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết tách tanin, nhận thấy lượng tanin tách được càng nhiều khi tăng thời gian thực hiện phản ứng từ 30 lên 75 phút và giá trị lúc này đạt mức ổn định. Nghiên cứu của Đỗ Biên Cương về sử dụng bã cơm dừa tạo prebiotic cũng cho thấy thời gian là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình chuyển hóa.
3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA
Nghiên cứu tách chiết có thể thực hiện bằng cách sử dụng đơn yếu tố - one factor at a time approach (Chirinos và cộng sự, 2007; Kossah và cộng sự, 2010) hoặc dùng phương pháp bề mặt đáp ứng Response Surface Methodology (RSM) (Kiassos và cộng sự, 2009; Pompeu và cộng sự, 2009; Silva và cộng sự, 2007). M: Marker 1. 10 phút 2. 30 phút 3. 60 phút 4. 90 phút 5. 120 phút CG A
Phương pháp đơn yếu tố là phương pháp cổ điển, nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm mục tiêu. Khi yếu tố này được nghiên cứu thì các yếu tố khác được giữ cố định. Chính do vậy, đối với cách tiếp cận đơn yếu tố, ảnh hưởng của tương tác các yếu tố đến hàm mục tiêu không được tính đến. Kết quả thu được chỉ cho điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết nằm trong vùng tối ưu (Silva và cộng sự, 2007).
Phương pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp thống kê sử dụng dữ liệu thực nghiệm để xây dựng mô hình mô tả quá trình tách chiết trong đó có tính đến ảnh hưởng đơn yếu tố và tương tác giữa các yếu tố đến hàm mục tiêu. Phương pháp bề mặt đáp ứng khắc phục được các nhược điểm của phương pháp đơn yếu tố và được sử dụng khá phổ biến hiện nay trong tối ưu hóa quá trình tách chiết các hợp chất thứ cấp từ thực vật (Pompeu và cộng sự, 2009; Radojkovic và cộng sự, 2012; Silva và cộng sự, 2007). Phương pháp này cũng được dùng để tối ưu hóa quá trình tách chiết chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh trong nghiên cứu này.
3.2.1. Kết quả ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố
Dựa trên cơ sở đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cà phê xanh thích hợp thu CGA, đề tài đưa ra các mức thí nghiệm của mô hình tối ưu hoá. Đối với tỷ lệ nguyên liệu cơ chất – dung môi, tỷ lệ 1 – 50 cho hàm lượng CGA cao nhất vì vậy chọn giá trị trung tâm cho thí nghiệm là 50, khoảng biến đổi là 10. Đối với nồng độ enzyme, chọn nồng độ 40 U/g là giá trị tại tâm, khoảng biến đổi là 10 U/g. Đối với thời gian thuỷ phân, chọn 60 phút là thời gian thuỷ phân tại tâm, khoảng biến đổi là 30 phút.
Tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box – Behnken đến quá trình thủy phân cà phê xanh nhờ pectinase nhằm tìm điều kiện tối ưu để thủy phân cà phê xanh thu CGA.
Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau
TT Tỷ lệ cơ chất - dung môi (X1) Nồng độ enzyme (U/g) (X2) Thời gian (phút) (X3) Hàm lượng CGA (mg/g) 1 40 30 60 55,70 2 60 30 60 49,94 3 40 50 60 37,44 4 60 50 60 54,79 5 40 40 30 39,16 6 60 40 30 53,02 7 40 40 90 52,34 8 60 40 90 47,76 9 50 30 30 51,23 10 50 50 30 44,26 11 50 30 90 52,81 12 50 50 90 51,61 13 50 40 60 63,81 14 50 40 60 59,20 15 50 40 60 58,20 16 50 40 60 57,67 17 50 40 60 57,52
Kết quả từ bảng trên cho thấy hàm lượng CGA thu được sau thủy phân cà phê xanh bằng pectinase nằm trong khoảng từ 37,44 mg/g đến 63,81 mg/g tương ứng với thí nghiệm số 3 và số 13. Điều này cho thấy, trong các khoảng giới hạn đã chọn, các biến đều có ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân cà phê xanh thu CGA. Các mức cực tiểu và cực đại của các yếu tố, đều có sự chênh lệch về hàm lượng CGA thu dược.
Xét mức cực đại của yếu tố tỷ lệ nguyên liệu (thí nghiệm số 4) và mức cực tiểu (thí nghiệm số 3) sự chênh lệch về hàm lượng CGA khá lớn, khoảng 17,35 mg (từ 37,44 mg đến 54,79 mg). Trong khi đó, với yếu tố nồng độ enzyme, ở mức cực đại (thí nghiệm số 3) và mức cực tiểu (thí nghiệm số 9), lượng chênh lệch vào khoảng 13,79 mg. Xét các điểm cực đại và cực tiểu của yếu tố thời gian (thí nghiệm số 5 và 11) cũng cho thấy có sự chênh lệch đáng kể về lượng CGA thu được. Như vậy, cả ba yếu tố đã được lựa chọn có sự liên kết chặt chẽ trong việc tác động tới quá trình thủy phân cà phê xanh thu nhận CGA.
3.2.2. Phân tích phương sai
Sử dụng phần mềm DX 11 cho kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu thể hiện trên bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova)
Thông số SS df MS Chuẩn F Mức có nghĩa
Mô hình Tỷ lệ NL (X1) Nồng độ Enzyme (X2) Thời gian (X3) X12 743,26 54,39 58,30 35,53 144,46 9 1 1 1 1 82,58 54,39 58,30 35,53 144,46 18,31 12,06 12,92 7,88 29,57 0,0005 0,0104 0,0088 0,0263 0,0008
Thông số SS df MS Chuẩn F Mức có nghĩa X22 X32 X1× X2 X1× X3 X2× X3 Độ không tương thích 65,80 120,52 133,40 85,00 8,33 4,21 1 1 1 1 1 3 65,80 120,52 133,40 85,00 8,33 1,40 18,85 1,85 32,03 14,59 26,72 0,21 0,0065 0,0013 0,0010 0,0034 0,2164 0,8879 Trong đó: SS: tổng phương sai
df: bậc tự do
MS: trung bình bình phương các sai khác
Chuẩn F: chuẩn Fisher
Kết quả phân tích phương sai của mô hình tối ưu bằng phần mềm DX 11 (State – Ease) trình bày trong bảng trên (bảng ANOVA) cũng cho thấy cả 3 yếu tố là tỷ lệ nguyên liệu, nồng độ enzyme và thời gian đều ảnh hưởng tới quá trình thủy phân cà phê xanh bằng enzyme pectinase. Giá trị F của mô hình là 18,31 với p 0,0005 (p<0,05) cho thấy dạng mô hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Lack of Fit” là 0,8879 (p>0,05) cho thấy dạng mô hình này tương hợp với thực nghiệm. Giá trị p của X1*X2 và X1*X3 đều nhỏ hơn 0,05 cho thấy sự tác động đồng thời của nồng độ enzyme với tỷ lệ nguyên liệu và thời gian với tỷ lệ nguyên liệu tới quá tình thủy phân thu nhận CGA.
3.2.3. Phương trình hồi quy
Phương trình hồi quy biểu hiện hàm lượng CGA (Y) mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau:
Y = + 59,28 + 2,61*X1 – 2,7*X2 + 2,11*X3 + 5,77*X1*X2 – 4,61*X1*X3 + 1,44*X2*X3 – 5,86*X12 – 3,95*X22 – 5,35*X32.
Phương trình hồi quy cho thấy trong các hệ số b1, b2, b3 thể hiện tác động độc lập của từng yếu tố X1, X2, X3, giá trị tuyệt đối của b2 (2,7) là lớn nhất. Điều này chứng tỏ nồng độ enzyme có ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình thủy phân thu nhận CGA. Ngược lại, giá trị tuyệt đối của b3 (2,11) là nhỏ nhất, cho thấy sự ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tác động nhỏ hơn tới hàm mục tiêu. Khi đánh giá sự tác động đồng thời giữa các yếu tố, giá trị tuyệt đối của b12 (5,77) là lớn nhất, chứng tỏ sự tương tác giữa tỷ lệ nguyên liệu và nồng độ enzyme có ảnh hưởng mạnh tới quá trình thủy phân thu nhận CGA.
3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh bằng enzyme pectinase.
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng CGA thu được sau quá trình thủy phân bằng phần mềm Design Expert. Kết quả đã tìm được phương án thí nghiệm để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: Tỷ lệ cơ chất – dung môi 1 – 60, nồng độ enzyme là 43,548 U/g, thời gian thuỷ phân là 54,4 phút. Khi đó, hàm lượng CGA đạt được trong các điều kiện trên theo tính toán là 62,3077 mg/g mẫu cà phê nghiền. Kết quả hàm kỳ vọng mối tương quan giữa các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân quả cà phê xanh thu nhận CGA được biểu diễn trên hình 3.16 và hình 3.17.
Hình 3.15. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA
Dạng biểu diễn 3D
Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CGA
Thực nghiệm tại điều kiện dung môi pH 5,5, tỉ lệ cơ chất – dung môi 1 – 60, nồng độ enzyme 44 U/g, nhiệt độ thuỷ phân 50oC với tốc độ lắc khuấy 80 vòng/phút trong thời gian 55 phút, hàm lượng CGA dự đoán thu được là 62,3 mg/g.
Tiến hành kiểm tra mô hình với các điều kiện như trên thu được kết quả tại bảng 3.4 sau:
Bảng 3.4. Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hoá tách chiết CGA
TT Tỷ lệ cơ chất – dung môi (g/ml) Nồng độ enzyme (U) Thời gian (phút) Hàm lượng CGA (mg/g) 1 1 – 60 44 55 61,37 2 1 – 60 44 55 62,61 3 1 – 60 44 55 61,52 Trung bình 61,83
Sau khi tiến hành kiểm tra mô hình với các điều kiện tối ưu nhận thấy hàm lượng CGA thu được nằm trong khoảng 61,37 – 62,61 mg/g, nằm trong khoảng dự đoán của phương pháp quy hoạch bậc hai Box – Behnken nên mô hình đúng với thực nghiệm.
Hình 3.17. Sắc ký đồ kết quả trước và sau tối ưu hoá
Theo nghiên cứu của Trần Phương Thảo (2019), khi sử dụng phương pháp vi sóng và chiết ngâm để tách CGA bằng cà phê Robusta, kết quả thu được lượng CGA là 5,17- 5,31%/g chất khô. Trong khi đó, các nghiên cứu khác chỉ ra rằng cà phê Robusta cho hàm lượng CGA cao hơn so với cà phê Arabica. Từ đó có thể kết luận rằng sử dụng enzyme pectinase cho hiệu suất tách chiết CGA cao hơn phương pháp chiết ngâm.
3.2.5. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC HPLC
Kết quả xây dựng đường chuẩn CGA.
Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ
Nồng độ CGA (µl/ml) 10 20 50 100 200
Diện tích peak 1367,5 1387,5 1565,5 1726,6 2248,9 M: Marker
1. Mẫu trước tối ưu 2. Mẫu sau tối ưu
Hình 3.18. Đồ thị đường chuẩn CGA
Đường chuẩn CGA xác định được là: Y = 4,6287x + 1307.4 R2 = 0,9938
Kết quả xác định hàm lượng CGA trong dịch thủy phân bằng phương pháp HPLC
Hình 3.19. Sắc ký đồ của chất chuẩn CGA
Hình 3.20. Sắc ký đồ của mẫu thử CGA
Kết quả sắc ký đồ tại hình 3.20 cho thấy chất chuẩn sử dụng là 5-CGA phân tích trong 29 phút, CGA xuất hiện ở phút thứ 3, thời gian lưu trong
khoảng hơn 1 phút. So sánh với kết quả của mẫu thử hình 3.21, nhận thấy có sự trùng khớp khi ở phút thứ 3 cũng có đường sắc ký hiện lên và lưu lại đến qua phút thứ 4. Điều này chỉ ra rằng, trong mẫu thử tồn tại phân tử có cấu tạo giống với mẫu chuẩn.
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC
TN
Hàm lượng CGA (mg/g) Máy đo quang phổ
(324nm) Hệ thống HPLC 1 37,44 35,07 2 63,81 61,40 3 58,25 56,19 4 61,83 59,03
Chú thích: TN1- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 3 trong ma trận thực nghiệm Box-Behnken; TN2- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 13 trong ma trận thực nghiệm Box- Behnken; TN3- Dịch thủy phân trước khi tối ưu; TN4- Dịch thủy phân sau khi tối ưu.
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy hàm lượng CGA trong dịch thủy phân xác định bằng phương pháp HPLC cho kết quả thấp hơn phương pháp đo bằng máy quang phổ. Điều này tương tự với kết quả của Abebe Belay và A.V.Gholap (2009) khi nghiên cứu cho thấy rằng lượng CGA thu được khi đo bằng máy quang phổ là (6,05-6,25%) cao hơn so với phương pháp đo bằng HPLC (5,6 – 6,1%).
3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa
3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn
Nghiên cứu ảnh hưởng của CGA đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn có lợi được thực hiện trên Bacillus clausii và vi khuẩn gây hại E. coli
trong môi trường chứa glucose hoặc CGA 1% (w/v). Kết quả thu được biểu diễn ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi khuẩn gây hại.
STT Chủng thử nghiệm
Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi (Tính theo LgCFU/ml) Môi trường + 1% Glucose Môi trường + 1% CGA 1 Lactobacillus acidophilus ATCC4356 7,88 ± 0,08 8,16 ±0,09 2 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,72 ± 0,09 6,85 ± 0,08 3 Lactobacillus plantarum 299V 7,02 ± 0,09 7,18 ± 0,08 4 Lactobacillus bulgaricus CH-3 6,57 ± 0,08 6,63 ± 0,09
5 Lactobacillus casei Shirota 7,14 ± 0,09 7,28 ± 0,09
6 Bacillus clausii 7,08 ± 0,09 7,13 ± 0,08