2.6.1. Phương pháp luận
Việc lựa chọn phương pháp nhân giống sinh dưỡng cho hệ số nhân giống cao để thay thế phương pháp nhân giống hữu tính rất có ý nghĩa. Đó là việc nhân giống vô tính giữ nguyên được tính trạng tốt của bố mẹ, không xảy ra hiện tượng phân ly tính trạng. Đồng thời cây con được tạo ra có chất lượng đồng đều. Đối với nhân giống theo phương pháp in vitro, việc sản xuất cây
giống được diễn ra quanh năm mà không cần quan tâm đến mùa vụ, thời tiết. Tiết kiệm được diện tích sản xuất, tạo ra giống sạch bệnh.
2.6.2. Nguyên tắc bố trí thí nghiệm
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, trong đó nhất định phải có công thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu cần đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm.
- Số mẫu của các công thức thí nghiệm cần đủ lớn (n ≥ 30).
2.6.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể đối với nội dung nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
2.6.3.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
- Cách lấy mẫu: Chọn những cây Đinh lăng lá nhỏ có thân thẳng, tán lá đều, sản lượng củ (rễ) cao, sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh. Mẫu thí nghiệm là những chồi bánh tẻ lấy từ thân và cành của cây Đinh lăng lá nhỏ.
Bảo quản mẫu: Dùng giấy báo để bọc mẫu và đựng trong túi ni non kín tránh thoát hơi nước.
Cách khử trùng mẫu:
+ Khử trùng ngoài buồng cấy: Sau khi thu mẫu về mẫu sẽ được xử lý sơ bộ và được rửa sạch, bụi bẩn dưới vòi nước chảy, ngâm mẫu trong nước xà phòng loãng khoảng 5 - 10 phút, lắc mạnh cho sạch hết bụi bẩn bám vào các kẽ của mẫu cấy, loại bỏ hết xà phòng và tráng bằng nước sạch nhiều lần.
+ Khử trùng trong buồng cấy: Cho toàn bộ mẫu vào bình thủy tinh nút xoáy, rót chất diệt khuẩn vào bình đến ngập mẫu, đậy chặt nút và lắc mạnh sao cho chất diệt khuẩn thấm sâu vào các kẽ, nách lá, đủ thời gian khử trùng thì loại bỏ chất diệt khuẩn và tráng mẫu bằng nước cất đã vô trùng nhiều lần (3 - 5 lần).
+ Khử trùng lần 1: Các mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó loại bỏ cồn và rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (rửa 3-4 lần).
+ Khử trùng lần 2: Sử dụng 2 loại hóa chất khử trùng là HgCl2 0,1% và NaOCl 60%, ở các công thức khác nhau có thời gian khử trùng khác nhau (bảng 3.1), sau đó loại bỏ dung dịch hóa chất khử trùng và rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (rửa 3 - 4 lần). Các công thức thí nghiệm được bố trí và theo dõi.
Các mẫu nuôi cấy sau khi khử trùng như trên được đưa ra đĩa inox vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của mẫu, rồi cấy mẫu vào môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose. Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25-27oC. Theo dõi và thu thập số liệu sau 1-2 tuần nuôi.
Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của hóa chất khử trùng
đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
Hóa chất Công thức khử trùng Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (mẫu) HgCl2 0,1% KT1 3 30 KT2 5 30 KT3 7 30 Javen 60% (NaClO) KT4 5 30 KT5 10 30 KT6 15 30
Mục đích thí nghiệm: Xác định công thức khử trùng thích hợp cho việc
vô trùng mẫu Đinh lăng nhằm tạo ra nguồn mẫu sạch ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp theo.
Vật liệu thí nghiệm: Chồi bánh tẻ lấy từ thân, cành của cây Đinh lăng
lá nhỏ
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ chồi tái sinh (%): (Tổng số chồi tái sinh/tổng số mẫu cấy)x100. - Tỷ lệ chồi không nhiễm (%): (Tổng số chồi không nhiễm/tổng số mẫu cấy)x100.
- Tỷ lệ chồi nhiễm (%): (Tổng số chồi nhiễm / tổng số mẫu cấy)x100
2.6.3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro
Sau khi khử trùng, chồi Đinh lăng được cấy vào môi trường tạo mẫu sạch để mẫu nảy chồi. Sau đó, chồi sạch được cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi. Các chồi/cụm chồi khác nhau được sử dụng làm vật liệu để nghiên cứu nhân chồi. Môi trường nhân nhanh chồi là môi trường cơ bản MS + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hoà sinh trưởng với các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây.
Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của
chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi
Đinh lăng lá nhỏ in vitro
CT MT BAP (mg/l) IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) ĐC 0 - MS 30 NN1 0,1 - - MS 30 NN2 0,3 - - MS 30 NN3 0,5 - - MS 30 NN4 0,7 - - MS 30 NN5 1 - - MS 30
CT MT BAP (mg/l) IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) NN6 2 - - MS 30 NN7 0,3 0,1 - MS 30 NN8 0,2 - MS 30 NN9 0,3 0,3 - MS 30 NN10 0,5 - MS 30 NN11 0,5 0,5 0,1 - MS 30 NN12 0,2 - MS 30 NN13 0,3 - MS 30 NN14 0,5 - MS 30 NN15 0,1 - 0,2 MS 30 NN16 0,2 - MS 30 NN17 0,3 - MS 30 NN18 0,5 - MS 30 NN19 0,7 - MS 30 NN20 1 - MS 30 NN21 2 - MS 30
Mục đích thí nghiệm: Xác định được công thức môi trường thích hợp
cho sự phát sinh cụm chồi và tăng trưởng chồi Đinh lăng in vitro nhằm tạo số lượng lớn chồi phục vụ nhân giống in vitro.
Vật liệu thí nghiệm: Chồi Đinh lăng ở thí nghiệm phần 2.4.3.1. Chỉ tiêu theo dõi:
- Chiều cao chồi (cm): Đo từ mặt thạch lên đỉnh cao nhất của cụm chồi. - Số lượng chồi (chồi): Tổng số chồi/ Tổng số mẫu nuôi cấy.
2.6.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ cây Đinh lăng lá nhỏ in vitro
Sau khi tiến hành nhân nhanh chồi, các chồi đủ tiêu chuẩn (đạt kích thước 3-5cm) được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ TR (MS có bổ sung 15g/l đường, IBA và NAA với các nồng độ khác nhau). Thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây:
Bảng 2.3: Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa sinh
trưởng đến khả năng tạo rễ cây Đinh lăng lá nhỏ in vitro
Tên CTMT IBA (mg/l) NAA (mg/l) Tổng số mẫu cấy
TR0 0 - 30 TR1 0,1 - 30 TR2 0,3 - 30 TR3 0,5 - 30 TR4 1 - 30 TR5 - 0,1 30 TR6 - 0,3 30 TR7 - 0,5 30 TR8 - 1 30 TR9 0,1 0,1 30 TR10 0,3 30 TR11 0,5 30 TR12 1,0 30 TR13 0,1 0,3 30 TR14 0,3 30 TR15 0,5 30
Tên CTMT IBA (mg/l) NAA (mg/l) Tổng số mẫu cấy TR16 1,0 30 TR17 0,1 0,5 30 TR18 0,3 30 TR19 0,5 30 TR20 1,0 30 TR21 0,1 1 30 TR22 0,3 30 TR23 0,5 30 TR24 1,0 30
Mục đích thí nghiệm: Xác định được chất điều hòa sinh trưởng (IBA và
NAA) phù hợp cho tạo rễ của cây Đinh lăng in vitro, để tạo cây con hoàn chỉnh trước khi đưa ra trồng ở vườn ươm.
Vật liệu thí nghiệm: Chồi đủ tiêu chuẩn ra rễ được tách ra từ cụm chồi ở
thí nghiệm trước
Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian chồi tạo rễ (ngày nuôi cấy): Tính từ lúc cấy vào môi trường ra rễ.
- Số rễ TB/cây (rễ): Tổng số rễ ở các mấu chia cho tổng số mẫu thí nghiệm.
- Chiều dài TB rễ (mm): Tổng chiều dài rễ ở các mấu chia cho tổng số rễ ở các mẫu thí nghiệm.
2.6.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể của nội dung nhân giống bằng phương pháp giâm hom phương pháp giâm hom
Mục đích thí nghiệm: Xác định thành phần của giá thể để tiến hành
giâm hom cây Đinh lăng lá nhỏ đạt được tỷ lệ ra rễ cao nhất, hom giâm sau khi ra rễ sinh trưởng tốt nhất.
Vật liệu thí nghiệm: Các hom được lấy từ cây mẹ được tuyển chọn. Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ ra rễ (%): (Số hom ra rễ/số hom cấy) x 100; - Số lượng rễ cái/hom;
- Tỷ lệ cây xuất vườn: Số lượng cây xuất vườn/số lượng hom giâm.
Bảng 2.4: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Công thức thí nghiệm Giá thể Số lượng hom giâm (hom) GT1 Đất tầng B 90 GT2 50% đất tầng B + 50% cát non 90 GT3 50% đất tầng B + 25% cát non + 25% mùn cưa 90 GT4 50% đất tầng B + 50% mùn cưa 90
2.6.4.2. Ảnh hưởng của chiều dài hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Mục đích thí nghiệm: Xác định được chiều dài của hom giâm hợp lý
của cây Đinh lăng lá nhỏ để đạt được tỷ lệ ra rễ cao nhất, hom giâm sau khi ra rễ sinh trưởng tốt nhất và hệ số nhân giống cao nhất.
Vật liệu thí nghiệm: Các hom được lấy từ cây mẹ được tuyển chọn. Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ ra rễ (%): (Số hom ra rễ/số hom cấy) x 100; - Số lượng rễ cái/hom;
Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của chiều dài hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Công thức thí nghiệm Hom (cm) Số lượng hom giâm (hom)
HG1 5 cm 90
HG2 10 cm 90
HG3 15 cm 90
HG4 20 cm 90
HG5 25 cm 90
2.6.4.3. Ảnh hưởng của vị trí lấy hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Mục đích thí nghiệm: Xác định được vị trí lấy hom (loại hom giâm)
hợp lý của cây Đinh lăng lá nhỏ để đạt được tỷ lệ ra rễ cao nhất, hom giâm sau khi ra rễ sinh trưởng tốt nhất.
Vật liệu thí nghiệm: Các hom được lấy từ cây mẹ được tuyển chọn.
Hom được lấy tại 2 vị trí: Hom thân và hom cành.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ ra rễ (%): (Số hom ra rễ/số hom cấy) x 100; - Số lượng rễ cái/hom;
- Tỷ lệ cây xuất vườn: Số lượng cây xuất vườn/số lượng hom giâm.
Bảng 2.6: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của loại hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Công thức thí nghiệm Loại hom Số lượng hom giâm (hom)
LH1 Hom thân 90
2.6.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (IBA) đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm
Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ thích hợp của chất điều
hòa sinh trưởng IBA đối với hom giâm của cây Đinh lăng lá nhỏ để đạt được tỷ lệ ra rễ cao nhất, hom giâm sau khi ra rễ sinh trưởng tốt nhất.
Vật liệu thí nghiệm: Các hom được lấy từ cây mẹ được tuyển chọn. Sử
dụng loại hom, chiều dài hom và giá thể giâm hom tốt nhất đã xác định được ở các thí nghiệm trước.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ hom ra rễ (%): (Số hom ra rễ/số hom cấy) x 100; - Số lượng rễ cái/hom;
- Tỷ lệ cây xuất vườn: Số lượng cây xuất vườn/số lượng hom giâm.
Bảng 2.7: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (IBA) đến tỷ lệ ra rễ và phát triển của hom giâm Công thức thí nghiệm IBA Số lượng hom giâm (hom)
ĐH1 100 ppm 90 ĐH2 200 ppm 90 ĐH3 300 ppm 90 ĐH4 500 ppm 90 ĐH5 750 ppm 90 ĐH6 1000 ppm 90 ĐC 0 90
2.7. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu 2.7.1. Phương pháp kế thừa tài liệu 2.7.1. Phương pháp kế thừa tài liệu
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào, giâm hom rất đa dạng và phong phú. Do đó việc lựa chọn hóa chất và nồng độ của hóa chất và chất
điều hòa sinh trưởng, sự kết hợp chúng với nhau đều dựa trên các kết quả của thí nghiệm đã được nghiên cứu thực nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu là sự thu thập và kế thừa những thành quả nghiên cứu đã được công bố, các sách, báo, tạp chí, báo cáo khoa học trong nước và trên thế giới.
2.7.2. Thu thập số liệu
2.7.2.1. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
- Các chỉ tiêu thu thập: + Số mẫu cấy ban đầu; + Số mẫu sạch;
+ Số mẫu sạch tạo cụm chồi;
+ Số cụm chồi tạo thành sau mỗi chu kỳ cấy chuyển; + Số chồi cấy ban đầu;
+ Số chồi tạo thành sau mỗi chu kỳ cấy chuyển; + Số chồi ra rễ;
+ Số rễ tạo thành;
- Phương pháp thu thập :
+ Số liệu thu thập bằng phương pháp quan sát và đo đếm trực tiếp. + Số liệu thu thập theo chu kỳ cấy chuyển kỳ 3 - 4 tuần /lần, kể từ ngày cấy mẫu.
2.7.2.2. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật giâm hom
- Các chỉ tiêu thu thập: + Số hom giâm ban đầu; + Số hom ra rễ;
+ Số lượng rễ/hom;
+ Số hom sống, số hom chết;
- Phương pháp thu thập: Số liệu thu thập bằng phương pháp quan sát và đo đếm trực tiếp.
2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được ghi chép vào bảng biểu, xử lý trên máy tính bằng phần mềm Ecxel.
2.8.1. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro tính các chỉ số như sau: tính các chỉ số như sau:
Số mẫu sạch
+ Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100% Số mẫu ban đầu
Số mẫu tạo cụm chồi
+ Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) = x 100% Số mẫu sạch cấy ban đầu
Tổng số chồi hình thành + Hệ số nhân chồi (lần) =
Số chồi cấy ban đầu Tổng số chồi + Số chồi TB/cụm = Số cụm chồi Số chồi ra rễ + Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100% Số chồi cấy Tổng số rễ + Số rễ TB/chồi = Số chồi cấy
2.8.2. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp giâm hom tính các chỉ số như sau: tính các chỉ số như sau:
Số hom ra rễ
+ Tỷ lệ hom ra rễ (%) = x 100% Số hom ban đầu
Tổng số lượng rễ + Số lượng rễ trung bình/hom =
Tổng số hom ra rễ
Số hom đủ tiêu chuẩn xuất vườn
+ Tỷ lệ cây xuất vườn (%) = x 100% Số hom ban đầu
2 nguồn số liệu trên được xử lý bằng phần mềm thống kê toán học trong Lâm nghiệp (Nguyễn Hải Tuất, Vũ Tiến Hinh và Ngô Kim Khôi, 2006).
- Tính toán các đặc trưng mẫu
- Kiểm tra sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm bằng phân tích phương sai một nhân tố.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu nhân giống Đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
3.1.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
Trong nhân giống in vitro, tạo mẫu sạch được coi là một trong những khâu quan trọng nhất. Kết quả và tiến độ các bước tiếp theo của quy trình phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng và chất lượng nguồn mẫu sạch tạo được. Quy trình tạo mẫu sạch được thực hiện qua các bước sau:
Vật liệu nhân giống được lấy từ các cây Đinh lăng đã được tuyển chọn ở trên. Mẫu được lấy, bảo quản, xử lý và khử trùng theo các công thức thí
Hình 3.1: Cây Đinh lăng lá nhỏ
Chọn cây mẹ tốt để lấy vật liệu nhân giống: Chất lượng cây giống phụ thuộc rất nhiều vào nguồn vật liệu ban đầu. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn những cây mẹ có phẩm chất tốt theo một số tiêu chí như: Có thân thẳng, tán lá đều, sản lượng củ (rễ) cao, sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh.