1.5.1. Trên thế giới
Lĩnh vực nuôi cấy mô đã thu được nhiều thành tựu ở các cây trồng công nghiệp (cà phê, thuốc lá, cọ dầu, cao su,…), cây nông nghiệp, thực phẩm (khoai tây, lúa, bắp cải,…), cây cảnh (phong lan, cẩm chướng, huệ,…) (Albert Sassons, 1988; Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993; Bezborogov và các
tác giả, 1994). Đặc biệt trên lĩnh vực cây cảnh thì phong lan nuôi cấy mô được phát triển rất rộng rãi cả trong nước và ngoài nước (Nguyễn Thiện Tịch và các tác giả, 1988; Võ Thị Bạch Mai, 1996). Cây ăn trái lâu năm: cây khế, mãng cầu xiêm, măng cụt,… (Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993). Trong tạp chí “Plant physiology” (1988) và nhiều tài liệu khác, các nhà khoa học Nga cũng cho biết kết quả nuôi cấy mô nhiều loài cây khác nhau như thông, bạch dương,…
Ngày nay cây trồng từ cấy mô không chỉ quen thuộc với các nhà nghiên cứu, các nhà kinh doanh, sản xuất chuyên nghiệp mà cả những người nông dân, người làm vườn thủ công cũng đã biết và quan tâm tới như cây khoai tây, cây chuối,…
Tuy nhiên trên lĩnh vực cây trồng rừng, nhất là những cây quý, hiếm, lâu năm do những đặc thù riêng còn ít được nghiên cứu kể cả về chủng loài và quy mô nghiên cứu. Các kết quả đã có đều chủ yếu nghiên cứu cho các loài cây mọc nhanh, cây có giá trị kinh tế trong thời hạn kinh doanh ngắn, có khả năng mau chóng đáp ứng nhu cầu phủ xanh đất trồng và cung cấp được khối lượng nguyên liệu đáng kể cho nền kinh tế và đời sống người dân (nhựa mủ, gỗ, củi,…).
Reilly và Washev (1977) đã tách chồi mầm cây thông (Pinus sp.) được tách từ hạt gieo trong ống nghiệm. Từ những năm 1970 người ta đã nuôi cấy thành công mảnh lá, cuống lá, đoạn thân, rễ bạch đàn (Albert Sassons, 1988). Các nhà nghiên cứu Mỹ đã tạo được cây con từ nuôi cấy đoạn thân loài
Eucalyptus grandis, E. gunni, E. danrympleama ,… vào các năm 1977, 1979.
Năm 1973, Afocel đã khởi sự nghiên cứu nhân giống vô tính cây bạch đàn nhằm mục đích sản xuất lớn các dòng vô tính chịu lạnh, năng suất gỗ cao. Người ta đã tạo cây từ hạt nảy mầm trong ống nghiệm, hoặc cắt các chồi non từ các cây chọn lọc, từ cành ghép. Từ năm 1975, cây cấy mô được bắt đầu trồng ra ngoài đất với số lượng 20.000 cây / tháng.
Một số giống bạch đàn có năng suất cao, hay giá trị kinh tế về tinh dầu cũng được thử nghiệm ở nhiều nước nhiệt đới: Ấn Độ, Senegal, hàng năm từ một đoạn cành có thể cho 50.000 cây con hay hơn nữa (Albert Sassons, 1988).
Tại hội nghị Kaset Sart (Thái Lan, 1994) cũng đã báo cáo kết quả nhân giốngthành công 55 loài tre trúc và dự định phục vụ dự án trồng rừng của Thái Lan, với sản lượng 1 triệu cây con / năm (Pranon Prutgongse, 1994).
Ở Malaysia cũng đã có kết quả vi nhân giống các loài cây gỗ như
Acacia mangium; Gmelia arborea (Marziah Mahmood, 1995).
1.5.2. Ở Việt Nam
Với cây công nghiệp, chúng ta đã ứng dụng thành công phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần giải quyết nhu cầu nguyên liệu đối với một số cây trồng trọng điểm như: dứa Cayen, mía...theo phương pháp nhân cụm chồi của Mapes (1974). Với cây lương thực, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) tạo được cây khoai tây sạch virus, lập được ngân hàng giống khoai tây hay nuôi cấy bao phấn lúa tạo cây đơn bội.
Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng kháng bệnh, chọn dòng chịu muối, chịu mất nước. Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang được phát triển.
Nuôi cấy mô – tế bào còn được ứng dụng để nhân các cây chuyển gen nhằm tạo ra nhiều cây trồng chuyển gen với những đặc tính mong muốn như: tính kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ, kháng kim loại nặng và chống băng giá, chống hạn... đã thành công trên nhiều đối tượng như lúa, bông....
Đến nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của công nghệ sinh học hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng
công nghệ ADN tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạo giống và nhân nhanh giống hiện đại.
1.6. Tình hình nghiên cứu nhân giống vô tính cây Đinh lăng lá nhỏ
Đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ, như:
Nghiên cứu về sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in – vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harm của tác giả Lê Thiên Thư, Võ Thị Bạch Mai (2005). Kết quả đề tài đã chỉ ra được những kiểu phát sinh hình thái khác nhau của Đinh lăng lá nhỏ trong quá trình nuôi cấy mô.
Năm 2005, Trần Thị Liên, Nguyễn Văn Thuận, Đoàn Thị Thanh Nhàn đã “Nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harm bằng phương pháp in vitro”. Đề tài cũng đã đạt được một số kết quả bước đầu về
nhân nhanh được cây Đinh lăng bằng phương pháp in vitro. Tuy nhiên đề tài
mới chỉ bó hẹp trong phạm vi nhất định, chưa thí nghiệm với nhiều loại hóa chất và các nồng độ khác nhau. Tỷ lệ nhân nhanh còn hạn chế.
Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai đã bước đầu nghiên cứu tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng lá nhỏ. Kết quả Mô sẹo 14 tuần tuổi của cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms nuôi trên môi trường MS có bổ sung 2, 4 – D 2mg/l và 20% nước dừa là vật liệu tốt nhất để sử dụng làm vật liệu tạo dịch treo tế bào. Môi trường lỏng MS có bổ sung 2, 4 – D 1mg/l và 20% nước dừa là môi trường thu nhận các dòng tế bào cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L.
Harms có khả năng sinh phôi. Đó là các tế bào vách mỏng, đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc. Môi trường lỏng MS có bổ sung 2, 4 – D 1mg/l, BA 2 mg/l và 20% nước dừa là môi trường mà các dòng tế bào có khả năng sinh phôi của cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms tạo được rễ. Từ số lượng lớn rễ này có thể thu nhận saponin bằng các phương pháp li trích.
Năm 2013, Ninh Thị Phíp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật tăng khả năng nhân giống cây Đinh
lăng lá nhỏ. Kết quả đề tài đã khuyến nghị về loại cành đưa vào giâm hom, giá thể giâm hom, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA cho kết quả giâm hom tốt.
Việc nhân giống vô tính cây Đinh lăng lá nhỏ về cơ bản đã được triển khai và đạt được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên các nghiên cứu trước còn hạn chế về tính đa dạng của việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng, tỷ lệ mẫu sạch; hệ số nhân nhanh chồi còn thấp (đối với phương pháp in vitro). Giá thể sử dụng giâm hom chưa đa dạng; tỷ lệ ra rễ của các hom giâm
ở các công thức còn thấp… (Đối với phương pháp giâm hom). Do vậy việc tiến hành triển khai đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ
Polyscias fruticosa L. Harm bằng phương pháp nhân giống vô tính” ngoài
việc làm rõ hơn các kết quả của các nghiên cứu trước, đồng thời còn mở rộng, tạo sự đang dạng trong cách bố trí thí nghiệm cũng như sử dụng các loại hóa chất khác nhau. Góp phần nâng cao hiệu quả nhân giống cũng như chất lượng giống để phục vụ nhu cầu của thực tiễn sản xuất.
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được kỹ thuật nhân giống Đinh Lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và phương pháp giâm hom.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
- Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro; - Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro;
- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ cây Đinh lăng lá nhỏ in vitro;
2.2.2. Nhân giống bằng phương pháp giâm hom
- Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra rễ và sinh trưởng của hom giâm; - Ảnh hưởng của loại hom giâm đến đến tỷ lệ ra rễ và sinh trưởng của hom giâm;
- Ảnh hưởng của chiều dài hom giâm đến tỷ lệ ra rễ và sinh trưởng của hom giâm;
- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tỷ lệ ra rễ và sinh trưởng của hom giâm.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Đối với vật liệu dùng trong nhân giống in vitro: Sử dụng chồi bánh tẻ từ thân cây Đinh lăng lá nhỏ.
- Đối với vật liệu dùng trong giâm hom: Sử dụng đoạn thân và đoạn cành cây Đinh lăng lá nhỏ.
Những cây Đinh lăng lá nhỏ lấy vật liệu nhân giống đều được tuyển chọn.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp in vitro được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp.
Nội dung nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp giâm hom được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ Lâm nghiệp Thanh Hóa.
2.5. Thiết bị và hóa chất
- Thiết bị: Đề tài sử dụng các thiết bị, máy móc của Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp, gồm: Các loại box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nước cất một lần, hai lần, máy chuẩn pH, máy khuấy từ, dàn nuôi cây và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech,...
- Hóa chất: Môi trường sử dụng nuôi cấy in vitro cây Đinh lăng là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) cải tiến, các hóa chất được thể hiện ở phần phụ lục; các loại vitamin (B1, B6, vitamin C); các chất điều hòa sinh trưởng BAP (6- benzyl amino purine), Kin (Kinetin), IBA (indol – 3- butyric acid), NAA (naphthyl acetic acid), GA3 (gibberellic acid), than hoạt tính... được cung cấp bởi các hãng uy tín và chất lượng trên thế giới như Sigma, Research oganic (Mỹ), Merk (Đức), Wako (Nhật).
2.6. Phương pháp nghiên cứu 2.6.1. Phương pháp luận 2.6.1. Phương pháp luận
Việc lựa chọn phương pháp nhân giống sinh dưỡng cho hệ số nhân giống cao để thay thế phương pháp nhân giống hữu tính rất có ý nghĩa. Đó là việc nhân giống vô tính giữ nguyên được tính trạng tốt của bố mẹ, không xảy ra hiện tượng phân ly tính trạng. Đồng thời cây con được tạo ra có chất lượng đồng đều. Đối với nhân giống theo phương pháp in vitro, việc sản xuất cây
giống được diễn ra quanh năm mà không cần quan tâm đến mùa vụ, thời tiết. Tiết kiệm được diện tích sản xuất, tạo ra giống sạch bệnh.
2.6.2. Nguyên tắc bố trí thí nghiệm
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, trong đó nhất định phải có công thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu cần đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm.
- Số mẫu của các công thức thí nghiệm cần đủ lớn (n ≥ 30).
2.6.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể đối với nội dung nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
2.6.3.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
- Cách lấy mẫu: Chọn những cây Đinh lăng lá nhỏ có thân thẳng, tán lá đều, sản lượng củ (rễ) cao, sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh. Mẫu thí nghiệm là những chồi bánh tẻ lấy từ thân và cành của cây Đinh lăng lá nhỏ.
Bảo quản mẫu: Dùng giấy báo để bọc mẫu và đựng trong túi ni non kín tránh thoát hơi nước.
Cách khử trùng mẫu:
+ Khử trùng ngoài buồng cấy: Sau khi thu mẫu về mẫu sẽ được xử lý sơ bộ và được rửa sạch, bụi bẩn dưới vòi nước chảy, ngâm mẫu trong nước xà phòng loãng khoảng 5 - 10 phút, lắc mạnh cho sạch hết bụi bẩn bám vào các kẽ của mẫu cấy, loại bỏ hết xà phòng và tráng bằng nước sạch nhiều lần.
+ Khử trùng trong buồng cấy: Cho toàn bộ mẫu vào bình thủy tinh nút xoáy, rót chất diệt khuẩn vào bình đến ngập mẫu, đậy chặt nút và lắc mạnh sao cho chất diệt khuẩn thấm sâu vào các kẽ, nách lá, đủ thời gian khử trùng thì loại bỏ chất diệt khuẩn và tráng mẫu bằng nước cất đã vô trùng nhiều lần (3 - 5 lần).
+ Khử trùng lần 1: Các mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó loại bỏ cồn và rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (rửa 3-4 lần).
+ Khử trùng lần 2: Sử dụng 2 loại hóa chất khử trùng là HgCl2 0,1% và NaOCl 60%, ở các công thức khác nhau có thời gian khử trùng khác nhau (bảng 3.1), sau đó loại bỏ dung dịch hóa chất khử trùng và rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (rửa 3 - 4 lần). Các công thức thí nghiệm được bố trí và theo dõi.
Các mẫu nuôi cấy sau khi khử trùng như trên được đưa ra đĩa inox vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của mẫu, rồi cấy mẫu vào môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose. Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25-27oC. Theo dõi và thu thập số liệu sau 1-2 tuần nuôi.
Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của hóa chất khử trùng
đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
Hóa chất Công thức khử trùng Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (mẫu) HgCl2 0,1% KT1 3 30 KT2 5 30 KT3 7 30 Javen 60% (NaClO) KT4 5 30 KT5 10 30 KT6 15 30
Mục đích thí nghiệm: Xác định công thức khử trùng thích hợp cho việc
vô trùng mẫu Đinh lăng nhằm tạo ra nguồn mẫu sạch ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp theo.
Vật liệu thí nghiệm: Chồi bánh tẻ lấy từ thân, cành của cây Đinh lăng
lá nhỏ
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ chồi tái sinh (%): (Tổng số chồi tái sinh/tổng số mẫu cấy)x100. - Tỷ lệ chồi không nhiễm (%): (Tổng số chồi không nhiễm/tổng số mẫu cấy)x100.
- Tỷ lệ chồi nhiễm (%): (Tổng số chồi nhiễm / tổng số mẫu cấy)x100
2.6.3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro
Sau khi khử trùng, chồi Đinh lăng được cấy vào môi trường tạo mẫu sạch để mẫu nảy chồi. Sau đó, chồi sạch được cấy chuyển sang môi trường tạo cụm chồi. Các chồi/cụm chồi khác nhau được sử dụng làm vật liệu để nghiên cứu nhân chồi. Môi trường nhân nhanh chồi là môi trường cơ bản MS + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hoà sinh trưởng với các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây.
Bảng 2.2: Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của
chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi
Đinh lăng lá nhỏ in vitro
CT MT BAP (mg/l) IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) ĐC 0 - MS 30 NN1 0,1 - - MS 30 NN2 0,3 - - MS 30 NN3 0,5 - - MS 30 NN4 0,7 - - MS 30 NN5 1 - - MS 30
CT MT BAP (mg/l) IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) NN6 2 - - MS 30 NN7 0,3 0,1 - MS 30 NN8 0,2 - MS 30 NN9 0,3 0,3 - MS 30 NN10 0,5 - MS 30 NN11 0,5 0,5 0,1 - MS 30 NN12 0,2 - MS 30 NN13 0,3 - MS 30 NN14 0,5 - MS 30 NN15 0,1 - 0,2 MS 30 NN16 0,2 - MS 30 NN17 0,3 - MS 30 NN18 0,5 - MS 30 NN19 0,7 - MS 30 NN20 1 - MS 30 NN21 2 - MS 30
Mục đích thí nghiệm: Xác định được công thức môi trường thích hợp
cho sự phát sinh cụm chồi và tăng trưởng chồi Đinh lăng in vitro nhằm tạo số