2.7.1. Phương pháp kế thừa tài liệu
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào, giâm hom rất đa dạng và phong phú. Do đó việc lựa chọn hóa chất và nồng độ của hóa chất và chất
điều hòa sinh trưởng, sự kết hợp chúng với nhau đều dựa trên các kết quả của thí nghiệm đã được nghiên cứu thực nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu là sự thu thập và kế thừa những thành quả nghiên cứu đã được công bố, các sách, báo, tạp chí, báo cáo khoa học trong nước và trên thế giới.
2.7.2. Thu thập số liệu
2.7.2.1. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
- Các chỉ tiêu thu thập: + Số mẫu cấy ban đầu; + Số mẫu sạch;
+ Số mẫu sạch tạo cụm chồi;
+ Số cụm chồi tạo thành sau mỗi chu kỳ cấy chuyển; + Số chồi cấy ban đầu;
+ Số chồi tạo thành sau mỗi chu kỳ cấy chuyển; + Số chồi ra rễ;
+ Số rễ tạo thành;
- Phương pháp thu thập :
+ Số liệu thu thập bằng phương pháp quan sát và đo đếm trực tiếp. + Số liệu thu thập theo chu kỳ cấy chuyển kỳ 3 - 4 tuần /lần, kể từ ngày cấy mẫu.
2.7.2.2. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật giâm hom
- Các chỉ tiêu thu thập: + Số hom giâm ban đầu; + Số hom ra rễ;
+ Số lượng rễ/hom;
+ Số hom sống, số hom chết;
- Phương pháp thu thập: Số liệu thu thập bằng phương pháp quan sát và đo đếm trực tiếp.
2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được ghi chép vào bảng biểu, xử lý trên máy tính bằng phần mềm Ecxel.
2.8.1. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro tính các chỉ số như sau: tính các chỉ số như sau:
Số mẫu sạch
+ Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100% Số mẫu ban đầu
Số mẫu tạo cụm chồi
+ Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) = x 100% Số mẫu sạch cấy ban đầu
Tổng số chồi hình thành + Hệ số nhân chồi (lần) =
Số chồi cấy ban đầu Tổng số chồi + Số chồi TB/cụm = Số cụm chồi Số chồi ra rễ + Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100% Số chồi cấy Tổng số rễ + Số rễ TB/chồi = Số chồi cấy
2.8.2. Số liệu nhân giống Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp giâm hom tính các chỉ số như sau: tính các chỉ số như sau:
Số hom ra rễ
+ Tỷ lệ hom ra rễ (%) = x 100% Số hom ban đầu
Tổng số lượng rễ + Số lượng rễ trung bình/hom =
Tổng số hom ra rễ
Số hom đủ tiêu chuẩn xuất vườn
+ Tỷ lệ cây xuất vườn (%) = x 100% Số hom ban đầu
2 nguồn số liệu trên được xử lý bằng phần mềm thống kê toán học trong Lâm nghiệp (Nguyễn Hải Tuất, Vũ Tiến Hinh và Ngô Kim Khôi, 2006).
- Tính toán các đặc trưng mẫu
- Kiểm tra sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm bằng phân tích phương sai một nhân tố.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu nhân giống Đinh lăng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
3.1.1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro
Trong nhân giống in vitro, tạo mẫu sạch được coi là một trong những khâu quan trọng nhất. Kết quả và tiến độ các bước tiếp theo của quy trình phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng và chất lượng nguồn mẫu sạch tạo được. Quy trình tạo mẫu sạch được thực hiện qua các bước sau:
Vật liệu nhân giống được lấy từ các cây Đinh lăng đã được tuyển chọn ở trên. Mẫu được lấy, bảo quản, xử lý và khử trùng theo các công thức thí
Hình 3.1: Cây Đinh lăng lá nhỏ
Chọn cây mẹ tốt để lấy vật liệu nhân giống: Chất lượng cây giống phụ thuộc rất nhiều vào nguồn vật liệu ban đầu. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn những cây mẹ có phẩm chất tốt theo một số tiêu chí như: Có thân thẳng, tán lá đều, sản lượng củ (rễ) cao, sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh. (vì cây Đinh lăng chưa có tiêu chuẩn chọn cụ thể, trong giới hạn nghiên cứu của đề tài chưa có điều kiện để triển khai nghiên cứu, đánh giá sâu hơn). Vì vậy chúng tôi mới chỉ tuyển chọn những cây mẹ để lấy vật liệu nhân giống dựa trên một số tiêu chí cơ bản như trên. Kết quả đã tuyển chọn được 50 cây Đinh lăng lá nhỏ đáp ứng yêu cầu để lấy vật liệu phục vụ nhân giống.
nghiệm như đã mô tả ở phần phương pháp. Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose và nuôi ở điều kiện với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25 - 270C. Sau 2 tuần nuôi, kết quả thu thập được tổng hợp tại bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro chồi Đinh lăng lá nhỏ
Hóa chất Công thức thí nghiệm Thời gian (phút) Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu sạch (mẫu) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Số mẫu tái sinh (mẫu) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Thời gian nảy mầm (ngày) HgCl2 0,1% KT1 3 30 10 33,33 5 16,67 12 KT2 5 30 19 63,33 14 46,67 11 KT3 7 30 27 90,00 12 40,00 10 Javen 60% (NaClO) KT4 5 30 11 36,67 7 23,33 12 KT5 10 30 17 56,67 12 40,00 12 KT6 15 30 25 83,33 19 63,33 10
Hình 3.2. Ảnh hưởng của biện pháp khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro chồi Đinh lăng lá nhỏ
Kết quả tổng hợp ở bảng 3.1 cho thấy:
Khi sử dụng HgCl2 và NaClO để khử trùng chồi Đinh lăng lá nhỏ thì khả năng tạo mẫu sạch của HgCl2 tốt hơn NaClO. Cụ thể kết quả thí nghiệm đã chỉ ra rằng, trong khi HgCl2 có thể tạo ra tối đa 90% mẫu sạch (với thời gian khử trùng là 7 phút) thì NaClO chỉ có khả năng tạo ra 83,33% mẫu sạch (với thời gian khử trùng là 15 phút). Tuy nhiên khi cho các mẫu sạch tái sinh thì khả năng tái sinh tạo chồi của NaClO lại cao hơn HgCl2. Trong khi NaClO có thể cho tối đa 63,33% mẫu tái sinh chồi thì HgCl2 chỉ cho tối đa 46,67% mẫu tái sinh chồi.
Với từng chất khử trùng riêng lẻ, kết quả thí nghiệm cho thấy, khi dùng HgCl2 với nồng độ 0,1% trong khoảng thời gian 3, 5, 7 phút thì tỷ lệ mẫu sạch dao động trong khoảng 33,33% - 90%. Tỷ lệ mẫu sạch thấp nhất khi khử trùng với thời gian 3 phút, tỷ lệ mẫu sạch chỉ đạt 33,33%. Khi tăng dần thời gian khử trùng lên 5 phút, 7 phút thì tỷ lệ mẫu sạch tăng lên lần lượt là 63,33% và 90%. Tuy nhiên tỷ lệ mẫu cho tái sinh chồi lại không tuân theo quy luật như vậy. Khi khử trùng với thời gian 3 phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh chỉ đạt 16,67%, khi tăng lên 5 phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 46,67%. Tuy nhiên khi tăng thời gian khử trùng lên 7
phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh giảm xuống chỉ còn 40%. Kết quả trên có thể giải thích rằng do HgCl2 rất độc, khi kéo dài thời gian khử trùng thì HgCl2 có khả năng tiêu diệt hết nấm khuẩn trong mẫu cấy, nhưng nếu thời gian xử lý quá lâu thì HgCl2 thấm sâu vào tế bào chất phá huỷ chất nguyên sinh làm mẫu cấy hoá nâu sau chuyển sang màu đen rồi chết, làm giảm tỷ lệ mẫu tái sinh.
Khi khử trùng bằng NaClO 60% trong khoảng thời gian 5, 10, 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch tăng dần, lần lượt là 36,67%, 56,67% và 83,33%. Tương ứng với tỷ lệ tăng của mẫu sạch, tỷ lệ mẫu cho tái sinh chồi cũng tuân theo quy luật như vậy. Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi tăng dần khi tăng thời gian khử trùng, đạt kết quả lần lượt là 63,64%, 70,59% và 76%. Như vậy khi khử trùng bằng NaClO 60% với thời gian 15 phút thì cho tỷ lệ mẫu sạch và mẫu tái sinh chồi là cao nhất (lần lượt là 83,33% và 76%).
Như vậy: Với 2 loại hóa chất đã thí nghiệm, khi khử trùng chồi Đinh lăng lá nhỏ, nên sử dụng NaClO 60% với thời gian 15 phút sẽ cho kết quả tốt nhất. Chất lượng chồi tái sinh thu được đáp ứng tiêu chuẩn cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Đinh lăng lá nhỏ in vitro
Khi tạo được lượng lớn mẫu sạch in vitro, cho tỉ lệ nảy chồi cao, cắt và cấy chuyển các chồi tái sinh từ mẫu sạch sang môi trường nhân nhanh chồi với các công thức môi trường khác nhau như đã trình bày ở phần phương pháp. Trong môi trường này thành phần quan trọng và không thể thiếu là chất điều hoà sinh trưởng, nó quyết định đến hệ số nhân chồi. Chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng trong giai đoạn này là Cytokinin để kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro. Các loại Cytokinin
được sử dụng trong nuôi cấy mô – tế bào là BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin,....Trong quá trình nhân nhanh chồi có thể bổ sung Auxin nhưng với hàm lượng ít hoặc không đáng kể còn hàm lượng Cytokinin lớn hơn (Tỷ lệ hàm lượng Cytokinin/ Auxin thường lớn hơn 1) để kích thích tạo chồi.
Việc tạo được cụm chồi từ chồi Đinh lăng trong điều kiện in vitro là rất
quan trọng quyết định đến hiệu quả nhân giống (hệ số nhân giống cao). Các cụm chồi in vitro hình thành trong giai đoạn này sẽ là nguồn nguyên liệu cho nhân
nhanh chồi để tạo ra số lượng lớn chồi và cây con đáp ứng yêu cầu của sản xuất. Chồi in vitro được tạo ra không chỉ phụ thuộc vào trạng thái non trẻ của mẫu cấy, chất lượng mẫu cấy, loài cây mà còn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng. Khi mẫu cấy được tách rời đem nuôi trong các bình, ống nghiệm lúc đầu khả năng quang hợp còn rất thấp, nếu chúng không được cung cấp các chất dinh dưỡng đầy đủ thì dần dẫn sẽ chết. Vì vậy để các mẫu cấy có thể tồn tại, phân hoá và tiếp tục phát triển trong điều kiện in vitro, các mô, các cơ quan này cần được cung cấp các chất dinh dưỡng. Mặt khác, việc bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng (Cytokinin ,Auxin) vào môi trường sẽ làm tăng hiệu quả tạo cụm chồi in vitro cũng như sự sinh trưởng và phát triển của chồi.
Trong các thí nghiệm nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi, chúng tôi sử dụng đồng nhất môi trường cơ bản MS + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10%
nước dừa. Đồng thời có sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng đơn lẻ hoặc
phối hợp nhằm tìm ra công thức cho hệ số nhân chồi cao nhất.
3.1.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi
Sử dụng môi trường như trên có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra công thức cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi
CTMT BAP (mg/l) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu bật chồi (mẫu) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Số chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao chồi (cm) ĐC 0 MS 30 0 0 0 0 NN1 0,1 MS 30 5 16,67 1,25 1,05 NN2 0,3 MS 30 7 23,33 1,4 1,15 NN3 0,5 MS 30 14 46,67 1,45 1,10 NN4 0,7 MS 30 15 50,00 1,48 1,26 NN5 1 MS 30 20 66,67 1,87 1,35 NN6 2 MS 30 17 56,67 1,54 1,25
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính = 2,84 < F tra bảng
= 157,42 (Phụ biểu 01), điều đó cho thấy BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi.
Khi sử dụng BAP với hàm lượng 0,1mg/l, tỷ lệ mẫu cho tái sinh chồi chỉ đạt 16,67%, hệ số nhân chồi đạt 1,25. Khi tăng hàm lượng BAP lên 0,3g/l, tỷ lệ mẫu cho tái sinh chồi là 23,33%, hệ số nhân chồi đạt 1,4. Tiếp tục tăng hàm lượng BAP lên mức 0,5mg/l, 0,7mg/l và 1mg/l, thì tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và hệ số nhân chồi đều tăng, giá trị đạt cao nhất khi sử dụng BAP với hàm lượng 1mg/l, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 66,67% và hệ số nhân chồi là 1,87. Tuy nhiên tiếp tục tăng hàm lượng BAP lên 2mg/l thì các chỉ tiêu trên đều giảm xuống.
Song song với tỷ lệ mẫu bật chồi, hệ số nhân chồi thì sinh trưởng về chiều cao chồi của BAP với hàm lượng 1mg/l cũng thể hiện sự vượt trội so với các hàm lượng còn lại. Chiều cao chồi của hàm lượng BAP 1mg/l đạt 1,35 cm, vượt so với các hàm lượng còn lại từ 7 – 28%.
Tuy việc sử dụng BAP đã có hiệu quả rõ rệt đến việc tái sinh chồi Đinh lăng, nhưng so với yêu cầu của thực tiễn sản xuất thì rõ ràng hệ số nhân chồi như trên chưa đáp ứng được yêu cầu. Cần nghiên cứu thêm những công thức khác nhằm cải thiện được hệ số nhân chồi.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi
CTMT BAP (mg/l) IBA (g/ml) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu bật chồi (mẫu) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Số chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao chồi (cm) NN7 0,3 0,1 MS 30 8 26,67 1,37 1,15 NN8 0,2 MS 30 13 43,33 1,43 1,24 NN9 0,3 MS 30 15 50,00 1,35 1,10 NN10 0,5 MS 30 8 26,67 1,38 1,18 NN11 0,5 0,1 MS 30 19 63,33 1,87 1,26 NN12 0,2 MS 30 22 73,33 2 1,43 NN13 0,3 MS 30 17 56,67 1,68 1,20 NN14 0,5 MS 30 5 16,67 1,34 1,00
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính = 2,65 < F tra bảng
= 107,08 (Phụ biểu 02), điều đó cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của tổ hợp BAP+IBA đến tỷ lệ tái sinh chồi Đinh lăng.
Khi giữ nguyên hàm lượng BAP là 0,3mg/l và thay đổi hàm lượng IBA từ 0,1 - 0,5mg/l, công thức có tỷ lệ mẫu cho tái sinh chồi thấp nhất là NN7 với hàm lượng IBA là 0,1mg/l và 0,5mg/l, tỷ lệ chỉ đạt 26,67%. Công thức cho tỷ lệ tái sinh
chồi cao nhất là NN9 với 0,3mg/l BAP và 0,3mg/l IBA (tỷ lệ tái sinh đạt 50% và hệ số nhân chồi là 1,35).
Khi nâng hàm lượng BAP lên 0,5mg/l, hàm lượng IBA cũng dao động 0,1 – 0,5mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi và hệ số nhân chồi có sự thay đổi. Tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất là công thức NN14 khi IBA có hàm lượng 0,5mg/l, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi chỉ đạt 16,67%. Tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 73,33% và hệ số nhân chồi 2,00 ở công thức NN12 (0,5mg/l BAP + 0,2mg/l IBA). Khi tăng hàm lượng IBA lên trên 0,2mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi cũng như hệ số nhân chồi đều giảm.
Như vậy khi sử dụng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và IBA thì tỷ lệ tái sinh chồi, hệ số nhân chồi và chiều cao của chồi đạt cao nhất khi hàm lượng BAP và IBA tương ứng là 0,5mg/l và 0,2mg/l, các chỉ tiêu lần lượt là 73,33%, 2,00 và 1,43 cm. Tỷ lệ tái sinh chồi, hệ số nhân chồi và chiều cao của chồi có kết quả thấp nhất khi hàm lượng BAP và IBA đều là 0,5mg/l.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi được thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi
CTTN Kinetin (mg/l) BAP (g/ml) Môi trường cơ bản Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu