Các kỹ thuật chẩn đốn sớm nhiễm HIV được thực hiện tại viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh từ những năm 2004 - 2005 là các xét nghiệm virút học nhằm phát hiện DNA. Phương pháp truyền thống sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại và phát hiện đoạn DNA hiện diện trong tế bào máu ngoại vi. Phương pháp này địi hỏi thực hiện trên cả ba gen chính của virút, gen pol, gag và env và khẳng định nhiễm HIV khi xét nghiệm cho cĩ kết quả dương tính với ít nhất hai trong ba gen. Kỹ thuật này địi hỏi thời gian, nhiều thao tác kỹ thuật và cịn hạn chế về độ nhạy.
Phương pháp Real - time PCR phát hiện RNA virút hiện diện trong huyết tương được phát triển sau đĩ cĩ độ nhạy cao hơn và đã cĩ các sản phẩm thương mại hố. Tuy nhiên độ nhạy và giá thành xét nghiệm rất thay đổi phụ thuộc vào các loại sinh phẩm. Tại phịng xét nghiệm HIV/AIDS viện Pasteur TP. HCM, sinh phẩm HIV- RNA real time PCR của Biocentric đã được lựa chọn và đánh giá trên các mẫu máu tại Việt nam do cĩ giá thành phù hợp với điều kiện ở Việt nam. Do RNA của virút rất dễ bị phá huỷ nên xét nghiệm địi hỏi phải thực hiện trên huyết tương trong vịng 6 giờ sau khi lấy máu.
Yêu cầu chẩn đốn sớm nhiễm HIV cho trẻ sinh ra từ mẹ cĩ huyết thanh dương tính ngày gia tăng, kỹ thuật Real - time PCR phát hiện HIV - DNA đã được
phát triển. Kỹ thuật này cĩ thể thực hiện trên cả mẫu máu tươi và mẫu máu lấy trên giấy thấm (DBS) giúp cho trẻ em ở các nơi xa phịng xét nghiệm cĩ thể được tiếp cận sớm với xét nghiệm chẩn đốn. Sinh phẩm Biocentric bán định lượng HIV - DNA dựa trên nguyên lý Real time PCR và sinh phẩm Roche Amplicor HIV - 1 DNA v1 với nguyên lý kỹ thuật PCR lai ghép đã được đánh giá so sánh.
Với mục tiêu nhằm đánh giá và lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm chẩn đốn sớm nhiễm HIV cho trẻ sơ sinh phù hợp với điều kiện kinh tế tại Việt Nam và các chủng virút lưu hành ở khu vực, chúng tơi thực hiện theo các bước như sau:
- Đánh giá và so sánh kỹ thuật chẩn đốn sớm nhiễm HIV với các kỹ thuật Real - time PCR DNA - HIV và Real - time PCR RNA – HIV.
- So sánh kết quả bộ kit Generic HIV DNA cell của Biocentric và bộ kit Roche Amplicor HIV - 1 DNA v1.5.
- Đánh giá tỷ lệ nhiễm HIV ở trẻ em sinh ra từ mẹ cĩ huyết thanh dương tính tại các tỉnh khu vực phía Nam.
II.1.CÁC THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HỐ CHẤT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao:
· Máy PCR Gene Amp 2400 (24 giếng)
· Máy PCR Eppendorf Mastercycler ProS
· Máy Real-time PCR ABI 7500
· Máy ủ khơ DTU-28
· Máy ủ khơ QB4 Grant
· Máy ly tâm lạnh Mikro 220R
· Máy xoay trộn Coulter Mixer
· Máy khuấy từ
· Máy vortex
· Máy rửa Plate
· Máy Evolis (dùng để đo OD)
· Nồi hấp ướt
· Pipetman các loại
· Đầu col cĩ phin lọc 1000 µL, 200 µL, 50 µL, 10µL
· Microtube vơ trùng 2.0 ml và 1.5 ml
· PCR tube 0.2 ml
· Giấy Watman 903
· Giấy thấm khơng bụi
· Giá phơi mẫu giấy
· Kìm bấm mẫu giấy
· Găng tay Latex khơng bột
Hố chất sinh phẩm
· Kit Qiamp viral RNA minikit của hãng QIAgen
· Kit HIV charge viral của Biocentric
· Kit Roche Amplicor HIV 1 DNA v1
· MgCl2 · Tris HCl · Trizma Base · KCl · Triton X-100 · Chelex 100 resin
· DNA Dilution Buffer 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris, pH 8.3)
· PBS 1X: 1lít, hấp ướt ở 121 oC/15 min.
· Wash Buffer (1X PBS, 0.5% (v/v) Triton X-100), 100 ml: + 10g Chelex 100 resin
+ Thêm 1X DNA Dilution Buffer đủ 100 ml
· Ethanol tuyệt đối và ethanol 70%
· Nước Javen 1%
· Nước khử ion, nước cất
II.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.2.1. Chọn mẫu nghiên cứu
· Tiêu chuẩn chọn mẫu
Ø Trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV hoặc sinh ra từ người mẹ cĩ xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV dương tính.
Ø Trẻ cĩ triệu chứng nghi ngờ nhiễm HIV hoặc cĩ xét nghiệm kháng thể kháng HIV dương tính.
· Lựa chọn bệnh nhân
Tư vấn cho mẹ hoặc cho người thân trẻ các nguy cơ nhiễm HIV từ mẹ sang con, lợi ích của xét nghiệm chẩn đốn, việc cho con bú sữa mẹ và nguy cơ lây nhiễm HIV, hướng dẫn lựa chọn cách nuơi dưỡng và chăm sĩc cho trẻ. Khi trẻ hội đủ các tiêu chuẩn chọn mẫu, mẹ và/hoặc người thân trẻ đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ Lập phiếu cam kết thực hiện xét nghiệm chẩn đốn nhiễm HIV cho trẻ dưới
18 tháng và phiếu yêu cầu xét nghiệm PCR, điền đầy đủ thơng tin và tiến hành lấy
mẫu (tham khảo phụ lục 2,3).
· Địa điểm thực hiện
Mẫu được thực hiện xét nghiệm tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
Các mẫu được thu thập tại Viện Pasteur TP. HCM và các mẫu từ bệnh viện Nhi Đồng 1, Nhi Đồng 2 của TP. HCM và các phịng khám ngoại trú Nhi thuộc các tỉnh thành khu vực phía Nam.
II.2.2. Quy trình thực hiện
II.2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu được lấy bằng hai cách (Hình II.1)
Mẫu máu nhỏ trên giấy thấm (DBS) được lấy từ các bệnh viện nhi, bảo quản và gửi đến viện Pasteur theo đúng hướng dẫn của Bộ Y tế (tham khảo phụ lục 1).
Mẫu máu tĩnh mạch 3-4 ml (được chống đơng bằng EDTA) của trẻ dưới 18 tháng tuổi được các bệnh viện nhi gửi đến phịng xét nghiệm HIV/AIDS Viện Pasteur TP. HCM để làm chẩn đốn sớm hoặc các mẫu được lấy trực tiếp từ Viện Pasteur TP. HCM, mẫu phải được xử lý trong vịng 4 – 6 giờ như sau:
Ø Chuẩn bị mẫu DBS từ ống máu tĩnh mạch: trộn đều ống máu, nhỏ 50 µL máu lên một vịng trịn trên giấy thấm, chuẩn bị 5 vịng cho mỗi mẫu bệnh phẩm. Để khơ hồn tồn ở nhiệt độ phịng thí nghiệm, sau đĩ bảo quản ở -20o
C trong bao ni lơng cĩ túi hút ẩm và giấy chỉ thị màu cho đến khi làm xét nghiệm (tham khảo phụ lục 1).
Ø Tách chiết huyết tương: lượng máu cịn lại được quay ly tâm 1.200 vịng/phút trong 5 phút và tách lấy huyết tương, chia nhỏ vào nhiều ống khác nhau và bảo quản ở -80oC cho đến lúc tiến hành xét nghiệm.
Sơ đồ II.1. Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu Chia nhỏ huyết tương 50µL Phơi khơ Đĩng gĩi và bảo quản
II.2.2.2. Các kỹ thuật sử dụng
Các kỹ thuật sử dụng trong đề tài cĩ thể tĩm tắt theo sơ đồ sau:
Sơ đồ II.2. Các phương pháp xác định nhiễm HIV sử dụng trong đề tài
a. Xác định nhiễm HIV bằng phương pháp Real-time PCR trên mẫu RNA tách
chiết từ huyết tương
Nguyên tắc chung:
RNA tổng số được tách chiết từ huyết tương bằng bộ kit Qiamp viral RNA minikit của hãng QIAgen theo nguyên tắc lọc qua cột cĩ lớp màng silicagel. RNA virút được giải phĩng bởi tác nhân phá màng tế bào và màng nhân được gắn với chất mang RNA (RNA carrier). Lớp màng silicagel cố định bên dưới cột của bộ kit chỉ bắt giữ phức hợp RNA - chất mang RNA. Các dung dịch rửa giúp loại bỏ những thành phần khơng mong muốn như protein và các ion. Thu nhận RNA bằng dung dịch pha lỗng mẫu cĩ chứa EDTA giúp ổn định vật liệu di truyền.
Phản ứng Real - time PCR RNA được thực hiện bằng bộ kit HIV charge viral của Biocentric – Pháp khuyếch đại đoạn gen mục tiêu dưới sự cĩ mặt của cặp mồi đặc hiệu trong vùng bảo tồn LTR của bộ gen HIV. Thơng qua tín hiệu huỳnh quang phát ra từ đầu 5’ của mẫu dị khi được men Taq DNA polymerase cắt trong qua trình kéo dài, nhận biết được số lượng bản mẫu ban đầu vì tín hiệu theo đường đồ thị sigma.
Các bước cụ thể:
- Tách chiết RNA từ mẫu huyết tương: mẫu luơn được tách chiết kèm theo 1 chứng dương và 1 chứng âm trong mỗi lần tách chiết. Mẫu RNA cần được bảo quản ở -80oC nếu khơng thực hiện phản ứng Real-time PCR ngay (Sơ đồ II.3).
140 µl huyết tương
+ 560 AVL-carrier RNA
ü vortex 15s
ü ủở to phịng trong 10 phút ü ly tâm ngắn (short spin)
+ 560 µl ethanol tuyệt đối
+ 500 µl AW1
ü vortex 15s
ü ly tâm ngắn
+ 60 µl dung dịch pha lỗng mẫu
RNA virút
(lưu ở 4oC nếu tiến hành PCR ngay)
(lưu ở -70oC nếu chưa sử dụng ngay)
Cho 630 µl qua cột
ü Ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút
ü Chuyển cột sang ống thu mẫu mới. Lặp lại
ü Ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút
ü Chuyển cột sang ống thu mẫu mới.
ü Ly tâm 13 000 vịng/phút trong 3 phút ü Chuyển cột sang ống 1.5ml mới ü Ly tâm 13 000 vịng/phút trong 1 phút ü Chuyển cột sang ống 1.5 ml mới + 500 µl AW2 ü Ủ 15-25oC trong 2 phút ü Ly tâm 9 000 vịng/phút trong 1 phút ü Bỏ cột
Sơ đồ II.3. Quy trình tách chiết RNA theo hướng dẫn của Qiamp viral RNA minikit
- Thực hiện phản ứng Real-time PCR RNA: phản ứng được thực hiện với
hệ thống máy ABI 7500 Prism.
· Pha lỗng mẫu chứng dương bậc 10 dùng làm đường chuẩn
· Pha hố chất và đặt phản ứng Real-time PCR
Phản ứng được thực hiện với các thành phần như sau:
- Primer A: 0.5 µL
- Primer B: 0.5 µL
- Probe C : 0.5 µL
- Reaction mix 2X : 12.5 µL
- H2O : 0.5 µL
- SuperScriptTM III RT/PlatinumR Taq Mix: 0.5 µL 60 µl RNA 50 µl (10 7 IU/mL) 10 µl RNA + 90 µl H2O 90 µl (10 6 IU/mL) Vortex 20 giây 10 µl RNA + 90 µl H2O Vortex 20 giây 90 µl (10 5 IU/mL) 90 µl (10 4 IU/mL) 10 µl RNA + 90 µl H2O Vortex 20 giây 100 µl (10 3 IU/mL) 10 µl RNA + 90 µl H2O Vortex 20 giây
Sơ đồ II.4. Quy trình pha mẫu làm đường chuẩn trong phản ứng Real-time PCR trên mẫu RNA
15.0 µL Mẫu RNA 10 µL
Tổng thể tích 1 phản ứng 25 µL
Chu trình luân nhiệt của phản ứng:
48oC ………….30 phút (phiên mã ngược) 95oC…………..10 phút (hoạt hĩa enzyme) 95oC…………..15 giây (biến tính)
60oC………….. 1 phút (lai)
Giai đoạn kéo dài của phản ứng PCR xảy ra trong quá trình nâng nhiệt từ 60oC lên 95oC.
b. Xác định nhiễm HIV trên mẫu DNA tách chiết từ mẫu DBS
Hiện nay tại Việt Nam, hai phương pháp sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm chẩn đốn sớm nhiễm HIV là phương pháp phát hiện DNA HIV dùng kit Generic HIV DNA cell của Biocentric – Pháp và kit Roche Amplicor HIV 1 DNA v1.5 của Roche. Chúng tơi thực hiện xét nghiệm tìm DNA HIV hiện diện trong mẫu bằng cả hai phương pháp nhằm so sánh hai kỹ thuật chẩn đốn sớm được dùng ở Việt Nam hiện nay.
· Phương pháp phát hiện DNA HIV dùng kit Generic HIV DNA cell của
hãng Biocentric – Pháp: Nguyên tắc chung:
DNA được tách chiết từ mẫu DBS bằng cách sử dụng dung dịch Chelex 100 theo SOP của phịng xét nghiệm HIV/AIDS của Viện Pasteur TP. HCM. Mẫu DBS sau khi được ly giải hồng cầu và loại bỏ những chất khơng cần thiết, được ủ ở
100oC dưới sự cĩ mặt của dung dịch Chelex, DNA sẽ được phĩng thích ra khỏi tế bào, ly tâm thu dịch nổi cĩ chứa DNA.
Phản ứng Real-time PCR DNA được thực hiện bằng bộ kit Generic HIV DNA cell của Biocentric khuyếch đại đoạn gen mục tiêu dưới sự cĩ mặt của cặp mồi đặc hiệu trong vùng bảo tồn LTR của bộ gen HIV với nguyên tắc tương tự như phản Phản ứng Real-time PCR RNA của Biocentric nêu ở phần trên.
Các bước cụ thể:
- Tách chiết DNA từ mẫu DBS: mẫu luơn được tách chiết kèm theo 1 chứng
dương và 1 chứng âm trong mỗi lần tách chiết. Mẫu DNA cần được bảo quản ở - 20oC nếu khơng thực hiện phản ứng Real-time PCR ngay.
v Sử dụng kềm bấm bấm 3 vịng trịn nhỏ từ vịng trịn cĩ máu khơ trên giấy DBS (5 mm/vịng trịn nhỏ) vào tube 2.0 mL đã ghi sẵn mã số.
v Thêm 1 mL Wash Buffer vào tube, đặt vào máy xoay trộn trong vịng 1 giờ ở nhiệt độ phịng (300 vịng/phút).
v Ly tâm tube ở 13000 vịng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch nổi. v Cho vào mỗi tube 230 µl 10% Chelex Solution
v Ủ tube ở 100 oC/30 min (vortex sau mỗi 15 phút) ở máy ủ nhiệt khơ. v Ly tâm tube ở 13000 vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong vịng 3 phút. v Hút 200 µl dịch nổi cho vào tube mới, khơng chạm vào phần cặn. Mẫu được lưu ở 4 oC trong thời gian chuẩn bị hố chất cho phản ứng PCR hoặc lưu ở -20 oC nếu khơng đặt phản ứng ngay.
- Phản ứng Real-time PCR DNA: Các bước pha lỗng đường chuẩn và đặt
phản ứng cũng tiến hành tương tự như đối với bộ kit HIV charge viral của Biocentric phát hiện RNA virút nêu ở phần trên. Phản ứng được thực hiện với các thành phần như sau:
- Primer A: 0.5 µL
- Primer B: 0.5 µL
- Probe C : 0.5 µL
- H2O: 6.0 µL
20.0 µL Mẫu DNA 5.0 µL
Tổng thể tích 1 phản ứng 25 µL
Chu kỳ luân nhiệt của phản ứng:
500C………….02 phút (phiên mã ngược) 950C …………..10 phút (hoạt hĩa enzyme) 950C…………..15 giây (biến tính)
600C………….. 1 phút (lai)
Giai đoạn kéo dài của phản ứng PCR xảy ra trong quá trình nâng nhiệt từ 60oC lên 95oC.
· Phương pháp phát hiện DNA HIV dùng kit Roche Amplicor HIV - 1 DNA,
version 1.5 của hãng Roche Nguyên tắc chung:
Sinh phẩm Amplicor HIV-1 DNA phiên bản 1.5 được dùng trong xét nghiệm phát hiện DNA HIV-1 trong máu người. Phản ứng PCR khuyếch đại đồng thời đoạn DNA mục tiêu và đoạn DNA dùng làm mẫu chứng nội cho vào trong quá trình tách chiết mẫu.
Sử dụng cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với các thứ týp thuộc nhĩm M của DNA HIV - 1 khuyếch đại một vùng trình tự dài 155 bp trong vùng bảo tồn cao nằm thuộc gen gag của HIV - 1. Phản ứng PCR xảy ra dưới sự hiện diện của enzyme
Thermus thermophilus DNA Polymerase là một enzyme tái tổ hợp chịu nhiệt (rTth
pol) và master mix trong thành phần phản ứng PCR cĩ chứa sẵn mồi được đánh dấu bằng biotin, trình tự mồi cĩ thể bắt cặp trên cả mẫu DNA HIV và mẫu DNA dùng làm chứng nội. Sản phẩm phản ứng PCR được lai với mẫu dị đặc hiệu. Kết quả được đọc bằng phương pháp đo OD ở bước sĩng 450 nm.
Các bước cụ thể: gồm cĩ 4 bước chính
- Tách chiết DNA từ mẫu DBS
v Mẫu DBS trước khi tách chiết cần phải lấy ra khỏi -20oC và để ở nhiệt độ phịng, mỗi lần tách chiết phải kèm theo 1 mẫu chứng dương và 3 mẫu chứng âm đi kèm theo kit.
v Bấm 3 vịng trịn nhỏ từ vịng trịn cĩ máu khơ trên giấy DBS (5 mm/vịng trịn nhỏ) vào tube đã ghi sẵn mã số.
v Thêm 1.4 mL dung dịch rửa Roche Specimen Wash Buffer vào mỗi ống và đặt tube lên máy trộn xoay trong 10 phút ở nhiệt độ phịng. Ly tâm 13000 rpm/phút trong 2 phút, hút bỏ dịch nổi (lặp lại 2 lần).
v Thêm vào 1.4 mL dung dịch rửa và ly tâm 13000 rpm/phút trong 2 phút. Hút bỏ tối đa dịch nổi (lưu ý khơng chạm kết tủa giấy).
v Chuẩn bị dung dịch tách chiết:
Dung dịch tách chiết là một hỗn hợp gồm dung dịch HIV-1 EXT và HIV-1 IC (chứng nội) với tỉ lệ cĩ trong hướng dẫn đính kèm theo kit, tuỳ thuộc vào số lượng mẫu tách chiết. Ví dụ để tách chiết 24 mẫu DBS, hút 6 mL HIV-1 EXT và 80 µL HIV-1 IC vào ống 50 ml.
v Chuẩn bị các mẫu chứng như sau:
Trộn đều các ống đựng mẫu HIV-1 (+) C và HIV-1 (-) C bằng máy vortex. Hút 50 µL mẫu cho mỗi mẫu chứng, chuẩn bị 1 mẫu chứng dương và 3 mẫu chứng âm trong một lần tách chiết.
v Cho 200 µL dung dịch tách chiết vào mỗi tube mẫu và chứng.
v Mẫu DBS được ủ ở 60oC trong 60 phút trong máy ủ nhiệt khơ, vortex vào phút thứ 30. Mẫu chứng ủ 60oC trong 30 phút, vortex vào phút thứ 15.
v Tiếp tục ủ các tube trong 30 phút ở 100°C, vortex vào phút thứ 15. v Vortex nhanh, ly tâm các tube 13000rpm/phút trong 1phút.