Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy khô tới khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Sấy mẫu đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC. Dưới tác dụng của nhiệt độ sấy làm bay hơi ẩm tự do và liên kết có trong mẫu. Độ ẩm của mẫu được tính dựa vào khối lượng giảm đi của mẫu trong quá trình sấy.
Công thức tính: 1 2 1 0 W(%) m m 100 m m Trong đó: W: Độ ẩm (%)
m1: Khối lượng mẫu và chén sứ trước khi sấy (g) m2: Khối lượng mẫu và chén sứ sau khi sấy (g) m0: Khối lượng của chén sứ (g)
Phân tích chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm TPCN từ cao củ gai
Thí nghiệm 11: Xây dựng chỉ tiêu cảm quan cho sản phẩm dịch chiết tổng từ củ gai STT Tên chỉ tiêu Yêu cầu của TCVN Sản phẩm cao củ gai
1 Màu Màu đặc trưng cho SP 2 Mùi Thơm đặc trưng cho SP 3 Vị Đặc trưng cho SP
Thí nghiệm 12: Xác định chỉ tiêu về vi sinh vật tổng số
Tên chỉ tiêu Sản phẩm cao củ gai
Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g)
E. Coli (CFU/g) Coliform (CFU/g)
Tổng số bào tử nấm (bào tử/g) Độc tố vi nấm (µg/kg)
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí xác định bằng phương pháp TCVN 4884:2005 - E. Coli được xác định bằng phương pháp TCVN 6846:2007
- Coliform được xác định bằng phương pháp TCVN 4882:2007
- Tổng số bào tử nấm được xác định bằng phương pháp TCVN 4993:1989 - Độc tố vi nấm được xác định bằng phương pháp TCVN 7596:2007
Thí nghiệm 13: Xác định chỉ tiêu về hàm lượng một số kim loại nặng độc hại
Tên chỉ tiêu Sản phẩm As Pb Cd Hg - As được xác định bằng phương pháp TCCS 03:2014 - Cd được xác định bằng phương pháp TCCS 06:2014 - Pb được xác định bằng phương pháp TCCS 06:2014 - Hg được xác định bằng phương pháp TCCS 09:2014
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nghiên cứu một số hoạt chất sinh học trong nguyên liệu lá gai và củ gai
3.1.1. Kết quả phân tích hoạt chất sinh học trong một số bộ phận cây gai xanh
Dựa trên những nghiên cứu của các tác giả đi trước tôi tiến hành phân tích các hoạt chất sinh học từ một số bộ phận của cây gai xanh, các chỉ tiêu được phân tích tại viện khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và được kết quả được trình bày bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng kết quả phân tích các hoạt chất sinh học trong một số bộ phận của cây gai xanh
STT Chỉ tiêu phân tích Lá tươi (100 g) Lá khô (100g) Rễ (củ gai) (100g) 1 Protein (g) 3,41 17,12 8,60 2 Chất béo (g) 0,52 2,42 0,42 3 Chất xơ (g) 3,10 15,4 2,91 4 Vitamin B1 (mg) 0,20 0,24 0,70 5 Vitamin B2 (mg) 0,30 0,32 0,90 6 Vitamin B3 (mg) 0,26 0,29 0,57 7 Vitamin B5 (mg) 0,39 0,42 0,64 8 Vitamin B6 (mg) 0,14 0,17 0,21 9 Vitamin B7 (mg) 0,07 0,09 0,04 10 Vitamin B9 (mg) 0,15 0,18 0,28 11 Vitamin B12 (mg) 0,21 0,26 0,16 12 Axit clorogenic (mg) 0,11 0,12 16,5 13 Axit protocatechuic (mg) 0,14 0,18 1,45 14 Axit cafeic (mg) 0,09 0,15 0,52 15 Axit quinic (mg) 0,05 0,08 0,43 16 Flavonoid rhoifolin (mg) 1,32 3,61 35,12 17 Apogenin (mg) 2,13 7,4 54,23 18 Sắt (mg) 150 755 150 19 Kẽm (mg) 0,34 1,52 0,33 20 Đồng (mg) 779 3.759 2.214 21 Iod (mg) 23 112 114 22 Selen (mg) 34 151 68 23 Mangan (mg) 1,64 1,64 3,46 24 Molybden (mg) 0,6 1,79 2,74 25 Cobal (mg) 0,3 1,51 4,93 26 Crom (mg) 0,24 1,12 4,72
Theo kinh nghiệm dân gian, thời điểm hái lá thông thường lớn hơn hoặc khoảng 90 ngày sau khi trồng và khoảng 60 ngày sau khi cắt bỏ gốc cũ là lá có độ dày, không quá già, màu xanh, kích thước lá khoảng 10 – 15cm..., thích hợp nhất cho quá trình hái lá. Như vậy, nguyên liệu lá gai có độ ẩm cao, trong thành phần chất khô có hàm lượng tro và polyphenol tổng khá cao, chứng tỏ lá Gai có những tính chất quý, vừa cung cấp khoáng chất vừa cung cấp các hoạt chất chống oxy hóa tự nhiên, kháng khuẩn, rất tốt để sản xuất các sản phẩm có lợi cho sức khỏe người sử dụng.
Năm 2010, G. Contò và cộng sự đã đánh giá về mức độ dinh dưỡng và thành phần hóa học của lá và ngọn cây lá Gai, là những phần không được sử dụng cho quá trình sản xuất sợi, phát hiện trong khối lượng khô của mẫu lá Gai có chứa protein thô với hàm lượng 17,00 ± 1,52% ở lá, 15,25 ± 0,77% ở ngọn và 11,79 ± 3,32% tính trên toàn bộ cây. Theo Tài nguyên Thực vật trong 100g cây gai xanh có chứa: nước, protein 85,3g, chất béo 0,5g, carbohydrates 5,4g, chất xơ 3,1g, tro 2g, vitamin A (beta caroten) 1,15mg, B1 (thiamine) 0,2mg, 0,39mg vitamin B5, 0,3mg pyridoxine, 0,1mg folic acid, 30mg vitamin C, 333mg vitamin E, 0,8mg vitamin K, 498,6mcg biotin, 0,5mcg choline, 17,4mg kali, 334mg canxi, 481mg magiê, 57mg sodium, 80mg photpho, 71mg chlorine, 150mg sắt, 1,64mg mangan, 779mg đồng, 76mcg selenium, 0,3mg kẽm…Theo kết quả phân tích trên cây gai xanh Cao Bằng thì các thành phần có lợi đều cao hơn hoặc bằng so với các công bố trước đây đối với cây gai xanh, đã chứng minh được cây gai xanh Cao Bằng có giá trị dược liệu cao so với trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Ngoài ra còn phát hiện Flavonoid rhoifolin và Apogenin là thành phần quan trọng ở lá của cây gai xanh. Dựa trên kết quả trên cho thấy với mẫu lá khô quy trình xử lý tốt, thất thoát hỏng không nhiều.
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai
Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn bởi nó như một chìa khóa vạn năng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học khác. Các chất chống oxy hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung
thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc điểm lý hóa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt … các chất này thường có bản chất là các polyphenon. Theo như tài liệu đã công bố của tác giả Dong Gu Lee (2015), cây gai xanh rất giàu polyphenon và cũng có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. Do vậy chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. DPPH là gốc tự do có màu tím hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm nó đại diện cho các gốc tự do có bản chất hóa học. Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa là chúng làm mất màu DPPH, quan sát khả năng làm mất màu DPPH của chất thử nhiều hay ít để có thể đánh giá mức độ chống oxy hóa của chất thử. Ở đây chúng tôi tiến hành thử khả năng bẫy gốc tự do DPPH của dịch chiết lá cây gai xanh. Kết quả được chỉ ra sau đây.
Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai
Dựa vào phương trình tuyến tính biểu diễn hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của cao chiết và chất đối chiếu, suy ra giá trị IC50. Kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được thể hiện qua giá trị IC50
Cao chiết Phương trình hồi quy R2
Nồng độ cao chiết ức chế 50% DPPH
(IC50) (µg/ml) Lá gai y = 0,076x + 4,959 R2 = 0,993 592,644
Acid ascorbic y = 6,8954x – 0,596 R2 = 0,9918 7,34
Kết quả cho thấy dịch chiết lá gai tại nồng độ 592,644 µg/ml có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH. So với giá tri ̣IC50 của vitamin C là 7,34μg/ml, dịch chiết lá gai thể hiện khả năng bắt gốc tự do 592,644μg/ml. So sánh với nghiên cứu được trình bày trong báo cáo của Youn Ri Lee và cộng sự 2009 trong nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa của lá cây gai xanh giá trị IC50 688,424 µg/ml [24]. Như vậy dịch chiết lá gai có tiềm năng sử dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên.
3.2.Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai
Qua kết quả phân tích bảng 3.1. hàm lượng flavonoid trong rễ(củ) gai đạt hàm lượng 35,12mg/100g cao nhất trong các bộ phận của cây gai xanh. Các nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học chính trong cây gai xanh là flavonoid, apigenin, axit hữu cơ và nhiều thành phần dinh dưỡng khác như khoáng chất, protein, vitamin [16]. Trong đó nhóm flavonoid rất được quan tâm nghiên cứu. Flavonoid từ cây gai xanh được biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi khuẩn, chống virus và chống dị ứng [12].
Việc chiết suất flavonoid từ cây gai xanh chịu ảnh hưởng bởi dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu.Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là nhằm tối ưu hóa quá trình chiết suất flavonoid tổng số từ cây gai xanh Cao Bằng. chúng tôi tiến hành sử dụng củ gai để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trong đó tập trung tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết suất.
Ethanol có khả năng chiết xuất hết thành phần của nguyên liệu cao hơn nước. Vì vậy dung môi được sử dụng trong việc chiết tách dịch cây gai xanh là ethanol. Tiến hành nghiên cứu với các nồng độ khác nhau là 60%, 70%, 80%. Sau đó tiến hành phân tích hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết. kết quả thu được về hàm lượng flavonoid được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng flavonoid
CT Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)
CT1 60 15,64a ± 0,43 CT2 70 17,88b ± 0,48 CT3 80 18,04b ± 0,21
Ghi chú: các chữ trong cùng 1 cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
Qua kết quả ở bảng 3.3 ta thấy khi trích ly ở các nồng độ ethanol khác nhau cho hàm lượng flavonoid khác nhau và hàm lượng này tăng lên khi chiết ở nồng độ ethanol từ 60% đến 80%. Flavonoid cao nhất tại nồng độ ethanol 80% tương ứng với hàm lượng flavonoid 18,04mg/100g. Hàm lượng flavonoid thu được thấp nhất ở 60% (15,64mg/100g). Khi trích ly ở nồng độ ethanol thấp quá thì khả năng trích ly flavonoid sẽ đạt hiệu quả không cao, nồng độ cao quá thì có xu hướng giảm đi.
Ethanol có khả năng hòa tan tốt các thành phần trong củ Gai: flavonoid thuộc nhóm flavon, favavon, flavanol… Độ tan của chúng không giống nhau ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ 70% và 80% không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Lưu Hồng Sơn (2017) [3], khi nghiên cứu tối ưu hóa flavonoid từ cây chè dây Cao Bằng nhận thấy, nồng độ ethanol 70% cho hàm lượng flavonoid cao nhất. Nồng độ ethanol thích hợp để thực hiện quá trình trích ly flavonoid trong củ gai là 70%, kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết suất.
Sau khi tìm được nồng độ ethanol thích hợp trong quá trình chiết suất flavonoid từ cây gai xanh chúng tôi tiến hành nghiên cứu với các khoảng thời gian chiết suất là 75, 90 và 105 phút. Sau đó tiến hành phân tích hàm lượng flavonoid tổng số. Kết quả thu được về hàm lượng flavonoid được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số
CT Thời gian (phút) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)
CT1 75 16,16a ± 0,22 CT2 90 17,90b ± 0,22 CT3 105 18,30b ± 0,14
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thông kê ở mức α < 0,05
Từ kết quả ở bảng 3.4 cho ta thấy, thời gian chiết suất có ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid. Nhìn chung khi tăng thời gian chiết suất, hàm lượng flavonoid thu được tăng. Hàm lượng flavonoid thu được ở CT2 và CT3 cao hơn so với CT1, nhưng giữa CT2 và CT3 lại không có sự khác biết ở mức ý nghĩa α = 0.05, mặc dù khoảng cách thời gian giữa các CT là 15 phút.
Từ nhận xét trên, để giảm thời gian sản xuất, tiết kiệm được chi phí, chúng tôi lựa chọn thời gian để chiết suất flavonoid tổng số là 90 phút.
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết suất
Trong quá trình trích ly, nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng, cứ tăng 10ºC thì tốc độ phản ứng tăng từ 2 – 4 lần. Tuy nhiên nhiệt độ cao làm cho các chất giảm hàm lượng và bị phân hủy, biến đổi thành những chất độc có thể gây hại cho cơ thể con người. Nhiệt độ thấp sẽ làm chậm quá trình trích ly và quá trình trích ly sẽ kéo dài mất rất nhiều thời gian, độ ẩm của sản phẩm sẽ cao và tạo điều kiện gây hư hỏng sản phẩm. Vì vậy cần phải tìm ra nhiệt độ trích ly thích hợp cho quá trình tạo ra sản phẩm cao củ gai. Thí nghiệm được tiến hành như thí nghiệm 3 mục 2.3.2 và thu được kết quả sau:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số
CT Nhiệt độ (ºC) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)
CT1 65ºC 22,87a ± 0,43 CT2 70ºC 23,31ª ± 0,29 CT3 75ºC 24,13a ± 0,46
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thông kê ở mức α < 0,05
Qua kết quả ở bảng 3.5 cho ta thấy trích ly ở các khoảng nhiệt độ khác nhau cho hàm lượng flavonoid khác nhau. Khi tăng nhiệt độ chiết suất từ 65ºC tới 70ºC thì hàm lượng flavonoid thu được tăng mạnh, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên tới 75ºC thì hàm lượng flavonoid thu được thay đổi không đáng kể và có xu hướng giảm đi. Theo Spigno và đồng tác giả (2007) [16], nhiệt độ trích ly tác động đến khả năng hòa tan, tốc độ truyền khối và sự ổn định của các hợp chất polyphenol. Từ kết quả trên, để tránh ảnh hưởng đến sự ổn định của hợp chất flavonoid của dịch chiết củ gai nhiệt độ tối ưu cho quá trình chiết suất được lựa chọn là 70ºC. Kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Hàm lượng dung môi ít hay nhiều cũng ảnh hưởng tới các chất cần trích ly và hiệu suất của quá trình trích ly. Nếu lượng dung môi ít sẽ không đủ cho quá trình hòa tan các hợp chất, chiết rút các cấu tử ra ngoài môi trường ít và chỉ làm đủ ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn sẽ gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Thí nghiệm này tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng flavonoid thu được và tìm ra tỷ lệ tốt nhất cho quá trình trích ly.
Thí nghiệm được tiến hành như thí nghiệm 4 trong mục 2.3.2 và kết quả được trình bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng số
Công thức Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi (g/ml) Hàm lượng flavonoid (mg/100g) CT1 1/10 18,95a ± 0,38 CT2 1/15 21,61b ± 0,63 CT3 1/20 23,11ª ± 0,60
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α < 0,05
Dựa vào kết quả ở bảng 3.6 ta thấy, khi thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thì hiệu quả chiết suất flavonoid cũng thay đổi và đều khác nhau giữa cả 3 công
thức nghiên cứu. Hàm lượng flavonoid thu được cao nhất ở CT3 là 23,11mg/100g và thấp nhất ở CT1 là 18,95mg/100g.
Dựa theo kết quả phân tích, để đảm bảo cho quá trình trích ly đạt được hiệu suất cao và tiết kiệm được lượng dung môi em lựa chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu