Hàm lượng dung môi ít hay nhiều cũng ảnh hưởng tới các chất cần trích ly và hiệu suất của quá trình trích ly. Nếu lượng dung môi ít sẽ không đủ cho quá trình hòa tan các hợp chất, chiết rút các cấu tử ra ngoài môi trường ít và chỉ làm đủ ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn sẽ gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Thí nghiệm này tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng flavonoid thu được và tìm ra tỷ lệ tốt nhất cho quá trình trích ly.
Thí nghiệm được tiến hành như thí nghiệm 4 trong mục 2.3.2 và kết quả được trình bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng số
Công thức Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi (g/ml) Hàm lượng flavonoid (mg/100g) CT1 1/10 18,95a ± 0,38 CT2 1/15 21,61b ± 0,63 CT3 1/20 23,11ª ± 0,60
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α < 0,05
Dựa vào kết quả ở bảng 3.6 ta thấy, khi thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thì hiệu quả chiết suất flavonoid cũng thay đổi và đều khác nhau giữa cả 3 công
thức nghiên cứu. Hàm lượng flavonoid thu được cao nhất ở CT3 là 23,11mg/100g và thấp nhất ở CT1 là 18,95mg/100g.
Dựa theo kết quả phân tích, để đảm bảo cho quá trình trích ly đạt được hiệu suất cao và tiết kiệm được lượng dung môi em lựa chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 15/1 làm kết quả sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.5. Kết quả tối ưu các điều kiện chiết suất dịch củ gai.
Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá tình trích ly củ gai em nhận thấy nồng độ dung môi ethanol, thời gian chiết tách và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình chiết suất củ gai. Sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box – Behnken với ba biến ba cấp độ được sử dụng trong nghiên cứu.
Các số liệu thu được từ dịch chiết củ gai được xử lí trên phần mềm Design – Expert 7 (Stat – Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá hàm lượng flavonoid thu được.
Bảng 3.7: Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố chiết củ Gai
TN Biến thực Hàm lượng flavonoid tổng số (mg/100g) A (ethanol) B (thời gian) C (tỷ lệ dung môi) 1 60 60 15 17,76 2 80 60 15 18,03 3 60 120 15 17,37 4 80 120 15 20,26 5 60 90 10 19,06 6 80 90 10 21,0 7 60 90 20 20,14 8 80 90 20 22,5 9 70 60 10 21,2 10 70 120 10 19,54 11 70 60 20 20,69 12 70 120 20 22,36 13 70 90 15 24,18 14 70 90 15 24,2 15 70 90 15 24,21 16 70 90 15 24,16 17 70 90 15 24,19
Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design – Expert 7 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lượng flavonoid trong cao củ gai đạt được hàm lượng cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện được hàm lượng flavonoid đạt được:
Y = + 24,39 + 0,93*A + 0,36*B + 0,74 *C + 0,66*A*B + 0,1*A*C + 0,58*B*C – 3,03*A2 – 3,01*B2 - 0.69*C2
Hay Y = + 24,39 + 0,93*ethanol + 0,36*thời gian + 0,74 *tỷ lệ dung môi + 0,66*ethanol*thời gian + 0,1*ethanol*tỷ lệ dung môi + 0,58*thời gian*tỷ lệ dung môi – 3,03*ethanol² - 3,01*thời gian² - 0,69*tỷ lệ dung môi²
Trong đó Y là hàm lượng flavonoid trong dịch chiết thu được.
Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.8: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết suất từ củ Gai Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p
Model 100,72 9 11,19 69,90 < 0,0001 A 6,96 1 6,96 43,45 < 0,0001 B 1,02 1 1,02 6,34 0,0003 C 4,34 1 4,34 27,09 0,00399 AB 1,72 1 1,72 10,72 0,0012 AC 0,044 1 0,044 0,28 0,0136 BC 1,36 1 1,36 8,48 0,0615 A² 38,60 1 38,6 241,1 < 0,0001 B² 38,03 1 38,03 237,53 < 0,0001 C² 1,98 1 1,98 12,35 0,0098 Residual 1,12 7 0,16 Lack of Fit 0,32 3 0,11 0,52 0.69 Sai số 0,81 4 0,20 SS tổng số 101.84 16
SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; Chuẩn F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích của mô hình với thực nghiệm.
Kiểm tra sự có ý nghĩa và sự tương thích của mô hình được tiến hành bằng phân tích bảng. Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value <0,0001 < 0,05 đo đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí nghiệm.
(a) (b) (c)
Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng hàm lượng flavonoid
a. Mô hình tương tác giữa nồng độ ethanol và thời gian. b. Mô hình tương tác giữa nồng độ ethanol và tỷ lệ dung môi. c. Mô hình tương tác giữa thời gian và tỷ lệ dung môi.
Hình 3.4. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu hàm lượng flavonoid trong dịch chiết
Sử dụng phương pháp “hàm kì vọng” để tối ưu hóa hàm lượng flavonoid thu được bằng phần mềm Design-Expert 7. Phương án tốt nhất được dự đoán nồng độ ethanol là 71,80%, thời gian là 92,06 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 18,04/1.
Khi đó hàm lượng flavonoid thu được đạt 24,7206 mg/100g. Kết quả thử nghiệm cho kết quả tương ứng cho thấy mô hình có độ tương thích cao.
3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm.
Quá trình cô đặc là quá trình làm giảm lượng dung môi có trong dung dịch trích ly, làm giảm hàm lượng hợp chất có trong dịch chiết, tạo được cấu trúc cho sản phẩm. Nhiệt độ cô đặc là yếu tố ảnh hưởng lớn tới chất lượng sản phẩm và quá trình cô đặc. Nếu nhiệt độ cô đặc cao thì sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, tạo ra các chất không mong muốn, phản ứng cháy sẽ làm cho sản phẩm có mùi khét, vị đắng chất lượng sản phẩm kém. Nhiệt độ thấp thì thời gian cô đặc sẽ kéo dài. Thí nghiệm được tiến hành như mục thí nghiệm 9 trong mục 2.3.4.2 và kết quả được thể hiện như bảng sau:
Bảng 3.9. Kết quả của ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm
CT Nhiệt độ (ºC) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)
CT1 60 23,65ª ± 0,56 CT2 65 23,36ª ± 0,62 CT3 70 23,12ª ± 0,67 CT4 75 22,38a ± 0,65
Ghi chú: các chữ trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05
Qua bảng 3.9 cho thấy: quá trình cô đặc ở các giá trị nhiệt độ khác nhau thì cho ra hàm lượng flavonoid khác nhau. Hàm lượng flavonoid giảm dần khi tăng nhiệt độ. Hàm lượng cao nhất đạt 23,65mg/100g ở nhiệt độ 60ºC. thấp nhất ở nhiệt độ 75ºC là 22,38mg/100g. Điều này có thể giải thích bởi vì nhiệt độ càng cao thì tốc độ phản ứng càng cao nên thời gian cô đặc nhanh hơn. Tuy nhiên nhiệt độ gây biến tính flavonoid dẫn đến hàm lượng thu được thấp hơn. Mặt khác ở công thức nhiệt độ 60ºC, 65ºC và 70ºC hàm lượng flavonoid thu được không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Vì vậy, lựa chọn nhiệt độ 70ºC là nhiệt độ của quá trình cô đặc.
3.2.7. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai
Cao lỏng củ gai là sản phẩm có dược tính cao, tốt cho sức khỏe con người, cao có màu nâu đỏ, dạng lỏng hơi sánh, khả năng hòa tan tốt, khi tan trong dung
môi cao có màu nâu đỏ ố vàng đặc trưng của củ gai. Tiến hành thí nghiệm phân tích chất lượng cao thành phẩm như thí nghiệm 10 trong mục 2.3.4.2 và kết quả được thể hiện như bảng sau:
Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai Mẫu Hàm lượng flavonoid (mg/100ml cao)
Cao lỏng củ gai 115,6
Từ bảng 3.10 ta thấy, sau quá trình khảo sát và tối ưu các điều kiện chiết suất cao củ Gai thì hàm lượng flavonoid đạt dc là 115,6 mg/100 ml. Sản phẩm có cảm quan tốt.
3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh học của cây gai xanh;
3.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá gai
Thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích ly từ lá gai, dịch chiết này chứa các hợp chất polyphenol, flavonoid trong đó có Chlorogenic acid là một loại tanin, có tác dụng diệt nấm, diệt khuẩn, được thử nghiệm để đánh giá hiệu quả kháng lại 3 loại vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis bằng phương pháp tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường đĩa thạch. Thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích lá gai thu được kết quả vòng kháng khuẩn như sau:
Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai với vi khuẩn lần lượt A: Escherichia coli, B: Bacillus subtilis, C: Staphylococcus. aureus và D:
Bảng 3.11. Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết lá gai kháng E. coli, B. subtilis và S. aureus STT Vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn Hiệu số đường kính vòng kháng khuẩn D-d (mm) Hoạt tính kháng của dịch trích 1 Escherichia coli 4 (++) 2 Staphylococcus aureus 7 (+++) 3 Bacillus subtilis 9 (+++)
Vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis là các tác nhân gây một số bệnh phổ biến ở người như các bệnh về đường ruột, tiêu hóa, ngộ độc thực phẩm, bệnh ngoài da, suy giảm hệ miễn dịch.
Qua thí nghiệm này ta có thể thấy được lá gai có thể kháng lại các loại vi khuẩn như trực khuẩn gram (-): Escherichia coli,trực khuẩn gram (+) Bacillus subtilis, tụ cầu khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus, với đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết tác động lên mỗi loại vi sinh vật là khác nhau.
Khả năng kháng khuẩn của dịch trích lá gai đối với chủng Bacillus subtilis là cao nhất với kết quả vòng kháng khuẩn là 9 mm và thấp nhất là chủng Escherichia coli
với 4 mm. Đối với chủng Staphylococcus aureus vòng kháng khuẩn là 7mm.
3.3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao củ gai
Tiến hành thí nghiệm với 2 đối tượng là: Bacillus subtilis, Escherichia coli.
Thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.3. Dung dịch chiết suất có các hàm lượng: 200, 150, 100, 75, 50µg.
Sau thời gian theo dõi kết quả: cho thấy cao củ gai có khả năng kháng khuẩn đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli. So sánh với đối chứng âm là nước cất vô trùng, đối chứng dương là kháng sinh Penicllin 30µg cho thấy tính kháng khuẩn của cao củ gai tốt.
Hình 3.6. Khả năng kháng khuẩn của cao củ gai đối với Bacillus subtilis và Escherichia coli Trong đó: (1). Cao củ gai ở nồng độ 200µg/ml (2). Cao củ gai ở nồng độ 150µg/ml (3). Cao củ gai ở nồng độ 100µg/ml (4). Cao củ gai ở nồng độ 75µg/ml (5). Cao củ gai ở nồng độ 50µg/ml (6). Đối chứng âm – nước cất
(7). Đối chứng dương – kháng sinh Penicillin 30 µg
3.4. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai
3.4.1. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc
3.4.1.1.Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu
Trong thí nghiệm phân tích một số thành phần hóa học có trong củ gai chúng tôi tiến hành phân tích xác định hàm lượng flavonoid như mục 2.3.1.1 và độ ẩm như mục 2.3.4.3.
Bảng 3.12. Bảng kết quả phân tích một số chỉ tiêu từ lá và rễ của cây gai xanh STT Chỉ tiêu phân tích Lá gai tươi
1 Độ ẩm (%) 80,69
2 Tro (%) 3.3
3 Hàm lượng chất khô hòa tan (ºBx) 19.3 4 Polyphenol tổng 13,35%.
Dựa vào bảng kết quả trên ta có độ ẩm của nguyên liệu lá Gai là 80.69%, của rễ (củ) gai là 86%. Hàm lượng chất khô lá chiếm 19.3%. Hàm lượng tro toàn phần trong lá gai 3.3%. Hàm lượng polyphenol tổng 13,35%.
Theo kinh nghiệm dân gian, thời điểm hái lá thông thường lớn hơn hoặc khoảng 90 ngày sau khi trồng và khoảng 60 ngày sau khi cắt bỏ gốc cũ là lá có độ dày, không quá già, màu xanh, kích thước lá khoảng 10 – 15cm..., thích hợp nhất cho quá trình hái lá. Như vậy, nguyên liệu lá gai có độ ẩm cao, trong thành phần chất khô có hàm lượng tro và polyphenol tổng khá cao, chứng tỏ lá gai có những tính chất quý, vừa cung cấp khoáng chất vừa cung cấp các hoạt chất chống oxy hóa tự nhiên, kháng khuẩn, rất tốt để sản xuất các sản phẩm có lợi cho sức khỏe người sử dụng.
3.4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình sản xuất
- Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy
Mục đích của quá trình sấy nhằm đưa độ ẩm của nguyên liệu về độ ẩm an toàn để bảo quản sản phẩm, nhiệt độ cũng là yếu tố làm biết đổi các thành phần hóa học sẽ bị biến đổi và giảm đi. Nếu sấy ở nhiệt độ quá thấp sẽ tốn thời gian và không tạo được hương vị tốt cho sản phẩm. Sấy ở nhiệt độ cao tốc độ sấy nhanh hơn. Cứ tăng 10oC thì tốc độ phản ứng tăng từ 2 – 4 lần. Tuy nhiên nhiệt độ cao gây ảnh hưởng chất lượng sản phẩm.Để lựa chọn nhiệt độ sấy thích hợp và không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng nguyên liệu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 4 công thức ở các nhiệt độ sấy khác nhau lần lượt 50°C, 60°C, 70°C, 80°C. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy được trình bày ở bảng 3.12 dưới đây.
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan nhiệt độ đến quá trình sấy
CT Nhiệt độ (oC) Điểm chất lượng Điểm TB Điểm HSCTL Màu sắc Mùi Vị Trang thái CT1 50 3,85a 3,57a 3,28a 4,20a 14,90 14,89 CT2 60 4,00a 4,00a 4,28a 4,00a 20,28 16,36 CT3 70 2,85b 3,25ab 3,27b 3,25b 12,64 12,57 CT4 80 2,76c 2,83bc 2,33c 2,33c 10,16 10,03
Ghi chú: các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa ≤ 0,05
Dựa vào bảng 3.13 ta thấy được nhiệt độ sấy nguyên liệu là yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm trà. Trong đó với công thức sấy ở 60ºC là tối ưu nhất cho quá trình sấy. Nhiệt độ sấy thấp hơn (50ºC), thời gian sấy kéo dài. Nhiệt độ sấy cao (70ºC, 80ºC) làm cho trà bị cháy khét, tính chất cảm quan sản phẩm giảm, màu sắc nhạt hơn và hương vị không được tốt các thành phần trong lá bị biến đổi do nhiệt độ cao, không còn thích hợp cho sản phẩm trà.
Sau khi đã có kết quả điểm cảm quan có thể nhận thấy với sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê của điểm cảm quan chất lượng sản phẩm ở các công thức khác nhau và với công thức 60ºC là công thức cho diểm cảm quan cao nhất so với những công thức còn lại. Vì vậy, công thức 60ºC là công thức tốt nhất được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
- Ảnh hưởng của thời gian sấy
Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ở mục 3.4.2.1 chúng tôi tiến hành chọn nhiệt độ sấy là 60oC để xác định thời gian sấy.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian sấy
CT Thời gian sấy (phút) Điểm chất lượng Điểm TB Điểm HSCTL Màu
sắc Mùi Vị Trang thái
CT1 15 3,86b 3,86b 3,43b 3,28b 14,43 14,34
CT2 30 4,00a 4,00a 4,14a 4,28a 16,42 16,45
CT3 45 3,50b 3,36b 3,40b 3,28b 13,78 13,57 CT4 60 3,72b 3,00b 3,57b 3,14c 13,43 13,15
Dựa vào bảng 3.14 cho thấy thời gian sấy khác nhau thì hàm lượng flavonoid cũng khác nhau. Khi sấy trong 30 phút thì hàm lượng flavonoid thu được cao nhất là 36,05 %. Khi tăng thời gian sấy từ 45 – 60 phút hàm lượng flavonoid giảm dần từ 32,78% xuống 31,83%. Kết quả đánh giá cảm quan theo TCVN 3215 – 79 cho thấy