Hệ sợi nấm khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể có thành phần dinh dưỡng khác nhau, kết quả sinh khối hệ sợi nấm sau khi được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS thông qua việc phân tích phương sai một nhân tố. Kết quả xác định công thức môi trường dịch thể nhân sinh khối hệ sợi tối ưu được trình bày dưới Bảng 3.11.
Bảng 3.11:Kết quả xác định môi trường dịch thể nhân sinh khối hệ sợi tối ưu TT Chủng nấm α Phân nhóm Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5 1 HL2 0,04 CT3 CT2; CT1 CT5; CT4 2 HL22 0,00 CT3 CT4; CT2 CT1 CT5 3 HL34 0,00 CT4; CT1 CT2; CT3 CT5 4 HL35 0,00 CT3 CT1 CT4 CT2 CT5 5 CM 0,00 CT1 CT5; CT2 CT3;CT4 6 F1010 0,00 CT3; CT4 CT1 CT2; CT5 7 F1012 0,01 CT4; CT1 CT3 CT5; CT2 8 F1080 0,00 CT1 CT4 CT3; CT5; CT2
Kết quả Bảng 3.11 cho thấy với α của Ftính của cả 8 chủng nấm Cordyceps
militaris đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ rằng sinh khối của hệ sợi nấm khi nuôi trong 5 công thức môi trường dinh dưỡng dịch thể khác nhau là rất khác nhau. Với kết quả phân nhóm theo Duncan như trình bày trong bảng trên thì thấy CT5 là công thức luôn được phân ở nhóm cho hệ sợi nấm sinh trưởng tốt nhất ở cả 8 chủng tức là nhóm cao nhất. Tuy nhiên có những chủng nấm thì không chỉ cho hệ sợi nấm tốt nhất trên một công thức mà có thể nhiều hơn ví dụ chủng HL2 sinh trưởng tốt nhất ở CT4, CT5. Chủng F1010, chủng F1012 sinh trưởng tốt ở CT2, CT5, chủng F1080 sinh trưởng tốt nhất trên 3 công thức CT2, CT3, CT5. Chủng CM cùng cho sinh trưởng tốt nhất trên 4 công thức là CT2, CT3, CT4, CT5. Các chủng còn lại như chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 sinh trưởng đạt tối ưu nhất trên một môi trường dinh dưỡng là CT5.
Ngoài ra khi nuôi cấy nấm trên môi trường dinh dưỡng có thành phần đường khác nhau như trên thì hệ sợi nấm cũng khác nhau ở màu sắc, độ dày hệ sợi, độ
bông xốp của hệ sợi. Trên CT5 (20g Glucoza/lít + 200g khoai tây/lít) là môi trường được đánh giá ít thành phần dinh dưỡng hơn thì sợi nấm mọc trắng, bông hơn so với các công thức môi trường còn lại. Mặt khác trên môi trường này sợi nấm mọc cũng tương đối nhanh và hệ sợi khoẻ. Trên môi trường CT4 hệ sợi nấm sớm chuyển từ màu trắng sang màu vàng da cam nhất. Trong điều kiện nuôi cấy trên môi trường dịch thể chủng CM có thể hình thành mầm thể quả nhưng nhỏ (Hình 3.31).
Hình 3.31: Chủng CM nuôi cấy trong môi trường dịch thể
Sau 8 ngày nuôi cấy với 8 chủng nấm đều cho kết quả sinh trưởng tốt nhất ở công thức CT5 môi trường dinh dưỡng dịch thể PD thể hiện sợi nấm mọc kín bề mặt sớm, nhiều chủng như chủng HL2, chủng F1010, chủng F1080 được đánh giá là mọc nhanh hơn hẳn so với các chủng khác vì nấm đã bắt đầu kín 100% bề mặt dịch thể. Ở công thức CT4 sợi nấm sinh trưởng cũng tốt gần bằng CT5 nhưng sợi đã bắt đầu chuyển từ màu trắng sang màu ngà. Ở các công thức môi trường dinh dưỡng còn lại sợi nấm trắng, mọc bông nhưng chậm. Công thức CT1, CT3 nấm sinh trưởng kém nhất ở cả 8 chủng sợi nấm mọc mới đạt 5 – 35% bề mặt dịch thể trong 8 ngày đầu. Sau 16 ngày kiểm tra hệ sợi ở nhiều công thức đã bắt đầu chuyển sang màu ngà đó là biểu hiện của sợi nấm bị già, riêng CT5 hệ sợi vẫn trắng, bông, khoẻ và mọc nhanh ở cả 8 chủng. Sau 21 ngày sợi nấm ở CT5 vẫn trắng và đẹp.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 HL2 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 Chủng nấm T rọn g l ư ợ n g k h ô h ệ s ợ i ( gr am ) CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
Hình 3.32: Sinh khối hệ sợi nấm trên các môi trường dịch thể khác nhau
Sinh khối hệ sợi nấm thu được sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường dịch thể được thể hiện rõ ở Hình 3.32. Ngoài ra Hình 3.32 cũng chỉ rõ chủng HL22, HL34, HL35 là 3 chủng có xuất xứ Việt Nam cho sinh khối hệ sợi thấp nhất so với các chủng còn lại. Sinh khối hệ sợi sau 21 ngày nuôi cấy chỉ đạt 75 – 90% bề mặt dịch thể ở công thức môi trường tốt nhất, trong khi đó các chủng khác đã đạt kín 100%. Và sinh khối hệ sợi chỉ đạt 0,25 – 0,8 gram ở công thức tốt nhất trong khi các chủng khác dao động từ 1,0 – 1,4 gram. Sau đây là hình ảnh minh họa sự khác nhau về sinh trưởng của 8 chủng nấm trên môi trường PD (Hình 3.33, Hình 3.34).
Hình 3.33: Chủng Cordyceps militaris
Từ kết quả thí nghiệm ở trên, đề tài chọn công thức CT5 môi trường dinh dưỡng dịch thể PD để làm môi trường dinh dưỡng dịch thể chính nhân sinh khối hệ sợi nấm. Lý do để lựa chọn môi trường trên mà không chọn môi trường khác mặc dù vẫn còn một số môi trường cho sinh trưởng tối ưu hơn đối với một số chủng. Thứ nhất ở môi trường dịch thể PD sinh trưởng của cả 8 chủng nấm đều tốt chứ không riêng một số chủng, thứ hai đây là môi trường đơn giản dễ làm, ít thành phần hoá chất, nguyên liệu làm đơn giản, rẻ tiền và sẵn có hơn so với 4 công thức môi trường dinh dưỡng còn lại.
3.4.2. Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy
Trong quá trình nhân sinh khối hệ sợi thì lắc là một khâu rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nếu lựa chọn được tốc độ lắc phù hợp cho nấm sinh trưởng nó góp phần làm tăng sinh khối hệ sợi. Thí nghiệm thực hiện với 4 công thức lắc như sau: CT1 – lắc 100 vòng/phút, CT2 – lắc 120 vòng/phút, CT3 – lắc 150 vòng/phút với thời gian 3 ngày để tĩnh 1 ngày lắc và CT4 – để tĩnh có lắc nhẹ 3 - 5 lần/ngày với 10 phút/lần. Đánh giá sinh khối hệ sợi cao hay thấp thông qua trọng lượng khô của hệ sợi, trọng lượng cao tương đương với sinh khối cao. Số liệu sau khi thu thập được xử lý qua phần mềm SPSS bằng việc phân tích phương sai 1 nhân tố, kết quả xác định tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng của nấm được trình bày trong Bảng 3.12.
Bảng 3.12:Kết quả xác định tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm TT Chủng nấm α Phân nhóm Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 1 HL2 0,00 CT3 CT1; CT4 CT2 2 HL22 0,00 CT3 CT4 CT1 CT2 3 HL34 0,00 CT3; CT4 CT1 CT2 4 HL35 0,00 CT3 CT1 CT4 CT2 5 CM 0,008 CT3; CT1; CT4 CT2 6 F1010 0,06 CT3 CT1 CT4; CT2 7 F1012 0,004 CT1 CT3; CT2; CT4 8 F1080 0,01 CT3; CT1; CT4 CT2
Kết quả xử lý số liệu cho thấy với α của F tính đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ tốc độ lắc có ảnh hưởng rõ tới sinh khối hệ sợi nấm. Nghĩa là khi nuôi cấy nấm ở môi trường dịch thể với tốc độ lắc khác nhau thì sinh khối của hệ sợi cũng sẽ khác nhau. Kết quả so sánh từng cặp sai dị của các công thức thí nghiệm và phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan cho thấy nhóm cao nhất trong bảng phân nhóm tức là nhóm cho sinh khối của hệ sợi lớn nhất luôn có mặt của CT2 ở cả 8 chủng nấm. Như vậy có thể thấy CT2 tương đương với tốc độ lắc 120 vòng/phút hệ sợi nấm sinh trưởng tốt nhất ở cả 8 chủng. Ngoài ra kết quả ở trên cũng cho thấy ở công thức CT3 lắc 150 vòng/phút xuất hiện nhiều ở nhóm 1 tức là nhóm cho sinh khối hệ sợi thấp nhất. Công thức CT1 lắc 100 vòng/phút sinh trưởng của hệ sợi cũng thấp hơn so với CT2 lắc 120 vòng/phút. Công thức CT4 để tĩnh có lắc nhẹ nấm sinh trưởng cũng tương đối tốt nhưng hệ sợi nấm mọc tập trung ở bề mặt trên môi trường dinh dưỡng là chính mà ít có trong dịch thể. Trong điều kiện cơ sở sản xuất không có đủ trang thiết bị phục vụ cho lắc thì có thể áp dụng CT4 nuôi tĩnh có lắc tay nhưng như vậy thì năng suất của hệ sợi thấp hơn và việc lắc từng chai một mất nhiều thời gian không thể đáp ứng được việc sản xuất với quy mô lớn. Sự khác nhau về sinh khối hệ sợi cũng được thấy rõ trên Hình 3.35.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 HL2 HL22 HL34 HL35 CM F1010 F1012 F1080 Chủng nấm T rọ ng lư ợn g kh ô hệ s ợi ( gr am ) CT1 CT2 CT3 CT4
Hình 3.35 mô phỏng rõ sinh trưởng của hệ sợi ở cả 8 chủng nấm đều cho trọng lương lượng khô cao nhất ở công thức CT2, nghĩa là điều kiện lắc 120 vòng/phút cho sinh khối hệ sợi nấm lớn nhất. Các chủng nấm HL22, HL34, HL35 có xuất xứ ở Việt Nam cho sinh khối thấp hơn so với các chủng còn lại trong thí nghiệm trong cùng thời gian nuôi cấy.
Lắc là khâu rất quan trọng trong quá trình nuôi nấm trong môi trường dịch thể vì nếu nuôi tĩnh hoàn toàn nấm vẫn có khả năng sinh trưởng được trên bề mặt dịch thể, nhưng như vậy hệ sợi nấm chỉ có ở bề mặt vì nổi phía trên và đóng băng kín cả bề mặt chứ không hề có trong dịch, nếu dùng dịch này để làm giống thì khi hút dịch đưa sang môi trường mới nấm rất khó mọc vì không có sợi. Việc lắc nhằm cắt đứt những sợi nấm mới ra còn non trộn lẫn đều trong môi trường dịch thể thứ nhất làm cho hệ sợi có thể sinh trưởng đều khắp trong thể tích bình chứ không chỉ trên bề mặt, thứ hai khi hút dịch thể ra đảm bảo được lượng hệ sợi để có thể mọc được trên môi trường mới, thứ ba không tạo cơ hội cho nấm mọc che kín bề mặt dịch thể.
Lý do ta không lắc liên tục 24/24giờ, mà nên lắc cách nhật vì kinh nghiệm cho thấy sau khi cấy sợi nấm vào môi trường dịch thể nên để 5- 7 ngày tuỳ theo chủng mọc nhanh hay chậm cho hệ sợi nấm bắt đầu mọc trên môi trường dịch thể sau đó mới tiến hành lắc vì khi mới cấy nấm sợi nấm chưa mọc ngay được trên môi trường mới, nếu đem lắc ngay thì sẽ làm sợi nấm ngập nước và chìm hẳn vào dịch thể, nấm bị ướt mọc sẽ khó và chậm. Quá trình lắc cũng vậy cần phải có thời gian để tĩnh cho những sợi nấm bị cắt đứt mọc được trên môi trường dịch thể.
Như vậy khi nhân sinh khối nấm trên môi trường dịch thể để sinh khối hệ sợi
nấm đạt hiệu quả cao thì nên lắc với tốc độ 120vòng/phút trong điều kiện 25oC, với
thời gian 1 ngày lắc 3 ngày để tĩnh.
Dưới đây là hình ảnh minh hoạ thí nghiệm lắc liên tục (24/24 giờ) và lắc cách nhật (lắc tốc độ 120vòng/phút với 3 ngày để tĩnh một ngày lắc) của 4 chủng nấm Cordyceps militaris của Việt Nam (Hình 3.36, Hình 3.37).
Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật