- Sưu tập các chủng nấm từ Trung Quốc và Nhật Bản.
- Phân lập các chủng nấm từ các mẫu Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam
- Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy thuần
khiết
- Lưu trữ và bảo quản giống gốc.
2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi - Tổng hợp nhân tố sinh thái cơ bản tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm
2.3.3. Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng nấm
- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm thu được
2.3.4. Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể
- Xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể thu sinh khối hệ sợi
- Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy
- Xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm
- Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy
- Tóm tắt quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Dụng cụ, thiết bị và môi trường dinh dưỡng
- Dụng cụ sử dụng: Que cấy, đèn cồn, dao chuyên dụng, dao, kéo, kẹp, hộp lồng
(đĩa Petri), lam kính, la men, thước đo, bình tam giác, lọ thuỷ tinh, ống cất giống, bình hút ẩm loại lớn, Pipet, dụng cụ đục giếng khoan, Dây lọc và một số dụng cụ khác.
- Thiết bị: Máy ảnh kỹ thuật số, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT, kính hiển vi quang học Olympus BX50, máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, tủ định ôn, tủ sấy, tủ lắc, tủ lạnh, nồi hấp…
- Nguồn lưu trữ tài liệu: sổ ghi chép, máy tính.
2.4.2. Phương pháp sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris Cordyceps militaris
2.4.2.1. Sưu tập nguồn gen
Thu thập và sưu tập các chủng nấm Cordyceps militaris từ trang trại nuôi
trồng nấm và ngân hàng gen của các nước Trung Quốc và Nhật Bản nhờ các mối quan hệ đã có .
2.4.2.2. Phân lập chủng nấm từ các mẫu Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam
Đặc điểm hình thái và giải phẫu: Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát, mô tả, chụp ảnh (hình dạng, kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường và kính hiển vi soi nổi. Phương pháp giải phẫu được thực hiện trên kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT, kính hiển vi quang học Olympus BX50, tách các mô tế bào để xem đặc điểm vi học của nấm như thể quả, túi bào tử, bào tử, đoạn bào tử (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…)
Phân lập: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi trường PDA
(Potato Dextrose Agar). Môi trường sau khi pha xong được hấp khử trùng ở 121oC
trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng vô trùng. Chọn mô nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh. Dùng cồn 70% rửa bề mặt nấm, tách lấy mô nấm bên trong thể quả cấy vào môi trường dinh dưỡng, sau khi cấy xong cất giữ mẫu
trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC. Chọn sợi nấm không bị tạp nhiễm mọc ra từ mô
nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Sau khi tách sợi nấm khoảng 2- 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp, và sợi nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết.
Đặc điểm hệ sợi nấm thu thập được ở Việt Nam trong nuôi cấy thuần khiết: Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA và được nuôi trong tủ định ôn có
nghiệt độ 250C. Định kỳ theo dõi sau 5 ngày quan sát mô tả cách thức mọc, màu
sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào tử vô tính (bào tử chồi) của nấm. Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo đếm và chụp ảnh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi soi nổi.
2.4.2.3. Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Cordyceps militaris
Nấm sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng PDA ở
nhiệt độ 25oC, đo đường kính sinh trưởng hệ sợi của các chủng nấm theo 2 chiều
vuông góc, lấy giá trị bình quân, đơn vị tính là mm. Tốc độ sinh trưởng của nấm được tính theo công thức:
T(μm/giờ) = Đường kính bình quân (mm)/(số giờ nuôi cấy)
2.4.2.4. Lưu trữ và bảo quản nguồn giống
Giống nấm sau khi phân lập được sợi nấm thuần khiết, chọn những đĩa nấm còn non hoặc bánh tẻ tiến hành cất giống và bảo quản nguồn giống. Giống được lưu
trữ trong các lọ lưu trữ mẫu có chứa nước cất đã được hấp khử trùng ở 121oC tương
đương với 1at thời gian 30 phút. Sau khi chuyển giống nấm vào lọ băng kín, ghi tên
đánh số kí hiệu và bảo quản trong tủ lạnh ở điều kiện 4oC. Quá trình cất giống được
Trong quá trình bảo quản, định kỳ kiểm tra sự sống của hệ sợi nấm 6 tháng một lần bằng cách cấy truyền giống nấm đang bảo quản lên môi trường dinh dưỡng, và tiếp tục cất giống. Đánh giá kết quả lưu trữ, bảo quản giống bằng tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết thuần khiết
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi trưởng và phát triển của hệ sợi
Thí nghiệm được thực hiện với 5 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi).
+ PDA: Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) + P10: Môi trường PDA + 10% Peptone
+ P20: Môi trường PDA + 20% Peptone + N10: Môi trường PDA + 10% Nhộng tằm
+ N20: Môi trường PDA + 20% Nhộng tằm
Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121oC và được đổ
vào các hộp lồng sạch, để nguội và cấy nấm. Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Sinh trưởng của hệ sợi đánh giá qua đường kính vòng sinh trưởng. Đường kính đo theo hai chiều vuông góc, số liệu thu thập và phân tích bằng bằng phần mềm SPSS.
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi trưởng và phát triển của hệ sợi
Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp (được lựa chọn trong thí nghiệm môi trường dinh dưỡng), đặt vào các thang nhiệt độ không khí
khác nhau: 150C, 200C, 250C, 300C và 350C. Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ
sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi). Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS.
2.4.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi và phát triển của hệ sợi
Phương pháp được tiến hành theo Both.C, pha NaCl với nồng độ khác nhau để tạo ra các thang độ ẩm không khí khác nhau: 75%, 80%, 85%, 90%, 95% và 100%, cụ thể như sau:
RH % 100 95 90 85 80 75
NaCl (g/lit) 0 8 16 24 32 40
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở nhiệt độ thích hợp như đã chọn trong mục 2.4.2.3, sau 3 ngày trong bình hút ẩm sẽ có độ ẩm không khí đã tạo. Nấm được cấy vào các hộp lồng chứa môi trường như đã chọn trong mục 2.4.2.2 và đặt vào các thang độ ẩm không khí như trên. Đo đường kính hệ sợi nấm theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân. Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS
2.4.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi của hệ sợi
Thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang pH khác nhau: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5. Điều chỉnh pH của môi trường bằng dung dịch HCl 10% và KOH 10%. Sau khi đã điều chỉnh pH môi trường đem hấp khử trùng ở
1210C tương đương 1 atm trong 30 phút. Cấy nấm vào các hộp lồng chứa môi
trường (đã chọn như mục 2.4.2.2) có độ pH khác nhau theo dõi ở thang nhiệt độ và độ ẩm không khí thích hợp (đã chọn ở trên). Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi). Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS.
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm
2.4.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm thu được
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm Cordyceps militaris
trên môi trường PDA của Ajay Kumar, Pragati Saini và J N Shrivastava, 2009 [17] cách làm như sau:
Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Nuôi cấy hệ sợi nấm của các chủng nấm Đông trùng hạ thảo cần thử hoạt tính trên môi trường lỏng sau 20 - 25 ngày lọc lấy dịch nuôi cấy. Các chất có hoạt tính sinh học do hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo tạo ra có trong dịch nuôi cấy.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Khuẩn được chọn để đánh giá hoạt tính
kháng khuẩn của nấm Cordyceps militaris là loài Bacillus subtilis.Môi trường PDA
được đổ ra các hộp lồng để nguội trang khuẩn Bacillus subtilis đều trên mặt thạch,
giữa hộp lồng khoan lấy 1 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 1ml dịch nuôi cấy
nấm vào giếng ở giữa hộp lồng. Nuôi cấy nấm trong điều kiện 250C, xác định
đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm thí nghiệm với 5 hộp lồng với 3 lần nhắc lại.
2.4.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm thu được
Đánh giá hoạt tính kháng nấm: Chuẩn bị dịch nuôi cấy giống như thí nghiệm kháng khuẩn trong mục 2.4.4.1. Môi trường PDA được đổ ra các hộp lồng, giữa hộp lồng khoan lấy 1 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 1ml dịch nuôi cấy nấm vào
giếng ở giữa hộp lồng. Để hộp lồng trong điều kiện nhiệt độ 40C cho các chất sinh
học khuếch tán ra môi trường PDA. Cấy nấm Fusarium oxysporum được chọn làm
đối tượng xác định hiệu lực kháng vào 3 góc của hộp lồng chứa dịch. Nuôi cấy nấm
trong điều kiện 250C sau 12 ngày xác định đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm
thí nghiệm với 5 hộp lồng và 3 lần nhắc lại.
2.4.5. Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi ở môi trường dịch thể
2.4.5.1. Phương pháp xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể
Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi được tiến hành trên 5 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau:
TT Công thức Mô tả công thức thí nghiệm
1 Công thức 1 40 g/lít glucose, 10 g/lít peptone, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4.3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O
2 Công thức 2 40 g/lít succose, 10 g/lít peptone, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4.3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O
3 Công thức 3 40 g/lít maltose, 10 g/lít peptone, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4.3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O
4 Công thức 4 40 g/lít fructose, 10 g/lít peptone, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4.3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O
5 Công thức 5 20g/lít Glucose, 200g/lít khoai tây.
Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường, 3 lần lặp; lắc với tốc độ 120 vòng/phút nuôi cấy trong 20 ngày. Thu hoạch hệ sợi và tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm.
2.4.5.2. Phương pháp xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy
Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy: Chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của hệ sợi trong thí nghiệm ở mục 2.4.5.1. Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường, 3 lần lặp. Thí nghiệm thực hiện với 4 công thức lắc như sau: CT1 – lắc 100 vòng/phút, CT2 – lắc 120 vòng/phút, CT3 – lắc 150 vòng/phút với thời gian 3 ngày để tĩnh 1 ngày lắc và CT4 – để tĩnh có lắc nhẹ 3 - 5 lần/ngày với 10 phút/lần. Thu hoạch hệ sợi ở thời gian đạt hiệu quả cao nhất, tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm.
2.4.5.3. Phương pháp xác định thời gian thu hoạch
Xác định thời gian nuôi cấy: Chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của hệ sợi để thực hiện thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường, 3 lần lặp; lắc với tốc độ thích hợp nhất đã chọn ở thí nghiệm trên. Thu hoạch hệ sợi ở thời gian sau 12, 16, 20, 24 và 28 ngày
nuôi cấy. Thu hoạch hệ sợi tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm.
2.4.5.4. Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy
Hệ sợi sau khi thu hoạch được sấy khô ở nhiệt độ thấp có quạt gió với các
thang nhiệt độ: 400C, 350C và 300C khi sản phẩm đạt độ ẩm 10-12% thì kết thúc
quá trình sấy, đóng gói sản phẩm. Để xác định được độ ẩm hệ sợi đạt 10 – 12%, áp dụng công thức tính sau:
W(%) = [(M1 – M2)/M2]x100
Trong đó: + W là độ ẩm tương đối
+ M1 là khối lượng hệ sợi tươi
+ M2 là khối lượng hệ sợi khô
2.4.5.5. Phương pháp sản xuất bột nấm Cordyceps militaris
Sau khi có nguồn giống, cấy truyền lên môi trường dinh dưỡng PDA, sau 10 -15 ngày sợi nấm mọc bông khoẻ, tiến hành cấy truyền trên môi trường dịch PD vô
trùng. Nuôi trong điều kiện 25oC, sau 20 -24 ngày thu hái hệ sợi nấm, lọc qua rây và
rửa qua bằng nước sạch, sấy khô ở nhiệt độ phù hợp, nghiền và đóng gói kín, được
sản phẩm là Bột hệ sợi nấm Cordyceps militaris. Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris
3.1.1. Sưu tập các chủng nấm từ Trung Quốc và Nhật Bản
Nhờ vào các mối quan hệ đã có, kết quả sưu tập được 4 chủng nấm
Cordyceps militaris từ ngân hàng gen, Viện quốc gia Khoa học Sinh học Nông nghiệp, 2-1-2 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602, Nhật Bản và từ trang trại nuôi trồng nấm ở Trung Quốc. Các chủng nấm sưu tập được có ký hiệu như sau:
Chủng Cordyceps militaris CM (chủng CM), Chủng Cordyceps militaris F1010
(chủng F1010), Chủng Cordyceps militaris F1012 (chủng F1012), Chủng
Cordyceps militaris F1080 (chủng F1080). Đặc điểm hệ sợi nấm của từng chủng được mô tả dưới đây:
Chủng Cordyceps militaris CM: Hệ sợi nấm lúc đầu màu trắng sau già chuyển màu ngà và dần dần chuyển màu vàng đậm da cam, sợi nấm dài mọc thẳng, hệ sợi mọc tròn đều về các hướng, bông và dầy 0,6, sinh trưởng tương đối nhanh trên môi trường nhân tạo. Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh. (Hình 3.1)
Chủng Cordyceps militaris F1010: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng, độ dầy hệ sợi 0,5. Nấm sinh trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh. (Hình 3.2)
Chủng Cordyceps militaris F1012: Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết, sợi nấm có màu trắng già có màu ngà, hệ sợi ngắn, ít bông, hệ sợi mỏng 0,2, hệ sợi sinh trưởng tương đối chậm. Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh. (Hình 3.3)
Chủng Cordyceps militaris F1080: Hệ sợi nấm màu trắng khi già chuyển màu ngà, hệ sợi rất bông, độ dày hệ sợi 0,7, nấm sinh trưởng nhanh trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết. Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử