Hom đƣợc lấy từ cây mẹ sinh trƣởng và phát triển tốt, không sâu bệnh hại, cắt những cành cấp 1 và chồi vƣợt tại huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh. Cành để cắt hom và hom đƣợc cắt vào buổi sáng, cắt xong để vào nƣớc để giữ ẩm cho hom.
- Dụng cụ cắt hom: Để tránh hiện tƣợng hom dập nát, trầy xƣớc cần cắt cẩn thận bằng kéo bằng dụng cụ chuyên dụng nhƣ dao, kéo loại sắc, mới.
- Giá thể giâm hom là nơi giâm hom đã đƣợc xử lý chất điều hòa sinh trƣởng, Trong trƣờng hợp này giá thể đƣợc chuẩn bị là đất rừng tầng B và trấu hun theo các tỷ lệ pha trộn khác nhau. Giá thể đƣợc đóng vào bầu PE màu đen (7x10cm) đặt vào luống đƣợc xây trong nhà lƣới có mái che, đảm bảo độ chiếu sáng 25-75%. Nhà giâm hom đủ tiêu chuẩn đặt tại trƣờng Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc- Quảng Ninh.
- Hóa chất: Chất điều hòa sinh trƣởng gồm 3 loại (ABT, IBA, NAA) với các nồng độ khác nhau từ: 0,5%, 1%, 1,5%, 2% dạng bột trong thời gian 5 phút. Hóa chất xử lý nấm là Benlat 0,5%
b) Các thí nghiệm
- h nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng sống và khả năng ra rễ của hom.
Chúng tôi lựa chọn đƣợc loại hom, kích thƣớc hom và diện tích lá để lại trên hom phù hợp ở các công thức thí nghiệm. Sử dụng với 3 chất điều hòa sinh trƣởng ABT, IBA, NAA dạng bột nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm và 200 ppm để theo dõi khả năng sống và khả năng ra rễ của hom. Thời gian xử lý chất ĐHST là 5 phút.
- h nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của loại hom đến khả năng sống của
hom.
Trong thí nghiệm này, dùng vật liệu là cành để cắt thành 2 loại hom (hom 1: là hom có đỉnh sinh trƣởng, hom 2: là hom phía dƣới kế cận hom 1). Kích thƣớc của hom khoảng 10 cm đến 15 cm. Sau khi cắt, hom đƣợc xử lý qua bằng thuốc diệt nấm sau đó đều đƣợc xử lý bằng cách chấm mặt cắt phía cực gốc của hom và thuốc kích thích ra rễ là công thức tốt nhất của thí nghiệm 1.
hom Trà hoa vàng
Thí nghiệm này lựa chọn giá thể là đất tầng B và trấu hun.
- h nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian che vòm bằng lƣới đen đến tỷ lệ sống của cây hom.
Thí nghiệm này chúng tôi cũng lựa chọn công thức tốt nhất ở thí nghiệm 1 để tiếp tục thí nghiệm với thời gian che vòm bằng lƣới đen đến tỷ lệ sống của cây hom.
c) Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp lại.
- Tất cả các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí với số lƣợng mẫu ≥ 30 và đo đếm cây tại vƣờn ƣơm.
- Chăm sóc thí nghiệm: Điều chỉnh ánh sáng phù hợp (độ chiếu sáng từ 25- 75%); tƣới phun đủ ẩm 2 lần/ngày cho tất cả các công thức thí nghiệm.
d) Thu thập số liệu, xử lý số liệu
Thu thập số liệu - Tỉ lệ hom sống (%) = x100 - Tỉ lệ hom ra rễ (%) = x100 - Số rễ trung bình =
- Thời gian thu thập số liệu: quan sát và đánh giá kết quả 10 ngày/lần và thu thập số liệu kết quả thí nghiệm sau 70 ngày.
Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Sau khi thu thập, số liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel 2013, dùng hàm ANOVA (analysis of variance) để kiểm tra sự sai khác về chỉ tiêu nghiên cứu giữa các công thức thí nghiệm.
- Trình tự nucleotide của gen đƣợc phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng nhƣ: DNA Club, BioEdit, Clustal X. Dựa trên trình tự của gen đặc hiệu ở cây dƣợc liệu, sử dụng công cụ Blast và Blas Tree View trong NCBI dể tạo cây quan hệ di truyền với các loài khác đã đƣợc công bố trên NCBI.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả xác định mã vạch AND (DNA barcode)
3.1.1. Tách chiết ADN và khuyếch đại PCR (Polymerase Chain Reaction)
ADN hệ gen của các mẫu nghiên cứu đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof et al., 1984[50] đã chứng tỏ sự hiệu quả (hình 3.1). Băng ADN thu đƣợc tƣơng đối gọn, tập trung phía trên đầu giếng và cũng không xuất hiện vệt sáng trong giếng của bản gel agarose 0,8%. Những đặc điểm này chứng minh rằng ADN tổng số thu đƣợc có kích thƣớc lớn, không lẫn protein, đủ điều kiện làm ADN khuôn cho khuyếch đại PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp).
Về nhân dòng PCR, kết quả cho thấy tất cả các đoạn mã vạch ADN đều đƣợc khuyếch đại thành công ở tất cả 06 mẫu nghiên cứu (hình 3.2). Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là 100%. Tỷ lệ thành công trình tự hai chiều đạt đƣợc từ sản phẩm PCR là 100% cho ba đoạn mã vạch ADN (bảng 3.1). Kết quả này khẳng định thêm chất lƣợng ADN đƣợc tách chiết, hàm lƣợng và kích thƣớc đủ lớn cũng nhƣ không lẫn các tạp chất gây ảnh hƣởng đến nhân dòng PCR. Hơn nữa, sản phẩm PCR đặc hiệu (xuất hiện 01 băng ADN với kích thƣớc đúng theo tính toán lý thuyết) của cả ba đoạn mã vạch ở tất cả các mẫu nghiên cứu chứng tỏ sự hiệu quả trong tối ƣu hóa quy trình PCR.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR với vùng rbcL từ 06 mẫu nghiên cứu Bảng 3.1: Đánh giá a vùng ADN đề xuất
Chỉ tiêu đánh giá matK rbcL ITS2
Tỷ lệ PCR thành công (%) 100 100 100
Tỷ lệ đọc trình tự thành công (%) 100 100 100
Chiều dài trình tự (bp) 921 589 367
Vị trí sai khác 0 2 3
Số nucleotide sai khác 0 2 3
Sự phân biệt (% nucleotide sai khác) 0 0,34 0,82
3.1.2. Phân tích trình tự nucleotide từ ba vùng ADN
Chất lƣợng trình tự nucleotide thu đƣợc là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ đọc thành công là 100%. Các trình tự này sau đó đƣợc chỉnh sửa, ghép nối bằng tay và phần mềm Bioedit version 7.2.5. Độ dài trình tự nucleotide phân tích thuộc vùng ADN lần lƣợt là 921bp, 589bp và 367bp cho matK, rbcL và ITS2 (bảng 3.1). Tiếp theo, lần lƣợt trình tự thuộc mỗi vùng ADN ở hai hệ gen (Trà hoa vàng Sơn Động, Bắc Giang và Trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh đƣợc so sánh trực tiếp nhằm tìm ra số nucleotide và vị trí sai khác, làm cơ sở cho việc kiểm định loài. Về cơ bản, nếu sự thay đổi trình tự nucleotide ở các mã vạch ADN giữa các loài là cao hơn trong một loài, chúng có thể đƣợc sử dụng nhƣ là mã vạch ADN cho định danh loài (Fabrizio et al., 2011)[46].
nghiên cứu với 111 trình tự nucleotide (tính đến ngày 23/10/2016) thuộc chi
Camellia đƣợc công bố trên ngân hàng GenBank, kết quả chỉ ra sự sai khác từ 1%
đến 2%. Đây là kết quả phổ biến và phù hợp khi so sánh gen matK ở mức độ giữa các loài thuộc cùng chi Camellia. Tuy nhiên, khi so sánh trực tiếp trình tự
nucleotide của gen matK giữa hai hệ gen Trà hoa vàng Sơn Động và Trà hoa vàng Ba Chẽ, kết quả chỉ ra sự sai khác là 0% (hình 3.3) Kết quả này nằm trong sự sai khác giữa các cá thể trong cùng loài.
Hình 3.3: So sánh trình tự nucleotide vùng matK giữa Trà hoa vàng Sơn Động và Trà hoa vàng Ba Chẽ
Tƣơng tự, với gen rbcL, kết quả khi so sánh với 193 trình tự trên ngân hàng GenBank, sự sai khác là từ 1% đến 3%. Đây cũng là sự khác biệt giữa các loài cùng chi. Tuy nhiên, sự khác biệt nucleotide trực tiếp giữa hai hệ gen nghiên cứu là kết quả khác, 0,34% (hình 3.4). Sự khác biệt này vẫn thuộc sự sai khác giữa cá thể cùng loài.
Hình 3.4: So sánh trình tự nucleotide vùng rbcL giữa Trà hoa vàng Sơn Động và Trà hoa vàng Ba Chẽ
Tƣơng tự với vùng ITS2, 1199 trình tự trên GenBank đƣợc so sánh, sự khác biệt thuộc sự sai khác giữa các loài, dao động trong khoảng từ 1 đến 5%, trong khi trực tiếp giữa hai hệ gen nghiên cứu là 0,82% (hình 3.5). Kết quả này vẫn thuộc sự sai khác giữa các cá thể trong loài.
Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotide vùng ITS2 giữa Trà hoa vàng Sơn Động và Trà hoa vàng Ba Chẽ
Nhƣ vậy, với ba vùng ADN đƣợc lựa chọn, matK và ITS2 đại diện cho sự
tiến hóa dẫn đến sai khác nucleotide đủ để đảm bảo cho sự phân định loài, trong khi
rbcL, đặc trƣng cho tính bảo thủ cao, thƣờng đƣợc sử dụng cho phân định cùng loài
(CBOL, 2009)[45]. Kết quả phân tích từ ba vùng trên đều cho sự khác biệt nucleotide giữa hai hệ gen nghiên cứu là Trà hoa vàng Sơn Động (Bắc Giang) và Trà hoa vàng Ba Chẽ (Quảng Ninh) thuộc sự sai khác giữa các cá thể cùng loài. Kết quả này phù hợp với công bố của Ngô Thị Minh Duyên và cộng sự (2011)[14].
3.2. Một số đặc điểm Lâm học Trà hoa Vàng
3.2.1. Đặc điểm hình thái loài cây Trà hoa vàng Ba chẽ
a) Đặc điểm hình thái cây
Cây gỗ nhỏ hay cây bụi (hình 3.6); nhánh mảnh, không lông. Lá có phiến thuôn, dài 11–14 cm, rộng 4–5 cm, không lông, mép có khía răng cƣa nhỏ, gân bên khoảng 10 đôi; cuống lá dài 6–7 mm. Nụ hoa mầu hồng (hình 3.7). Hoa (hình 1.1) mọc đơn độc trên cuống dài 7–10 mm; lá bắc 4; lá đài 5; cánh hoa 8-10, màu vàng đậm, cao 3 cm; nhị nhiều; bầu nhụy không lông, vòi nhụy 3-4, dính nhau một phần. Quả nang to 3 cm (hình 3.8), vỏ quả dày 3 mm. Sinh sống trong khu vực nghiên cứu có độ cao dƣới 150 m so với mực nƣớc biển.
Bảng 3.2: Kích thƣớc c y Trà hoa vàng tại Ba chẽ, Quảng ninh
Dg (cm) H vn(m)
TB Max Min TB max min
4,5 5,0 4,0 1,8 2,0 1,6
Từ kết quả ở bảng 3.2 ta thấy: cây Trà hoa vàng ở khu vực nghiên cứu có chiều cao trong khoảng từ 1,6 - 2 m, đƣờng kính thân cây trong khoảng từ 6 - 7cm. Dg trung bình của cây là 6,5cm, Hvn trung bình là 1,8 m.
Đặc điểm hình thái lá c y:
Bảng 3.3: Kết quả đo kích thƣớc lá c y Trà hoa vàng
Vị trí Lá trên ngọn Lá giữa tán Lá dƣới tán
TB Max Min TB Max Min TB Max Min
Dài (cm) 7 9 5 9 10 8 10,5 12 9
Rộng (cm) 3 4 2 4 5 3 4,5 5 4
Dựa vào kết quả đo kích thƣớc lá cây Trà hoa vàng bảng 3.3 và hình ảnh lá cây Trà hoa vàng ta thấy lá Trà hoa vàng có một số đặc điểm sau:
Lá có cuống, đơn mọc cách, không có lá kèm, kích thƣớc lá thay đổi, dài từ 5 - 12 cm, rộng từ 2 – 5 cm; chất lá thƣờng dạng da, dày; chóp lá nhọn kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm, tròn; mép có răng cƣa nhọn (Hình 3.9).
Đặc điểm hình thái hoa, quả:
Hoa mọc đơn ở đầu cành và lách lá; lá bắc 4, lá đài 5; cánh hoa 8-10, màu vàng đậm, cao 3 cm; nhị nhiều; bầu nhụy không lông, vòi nhụy 3-4, dính nhau một phần. Quả nang to trung bình 3 cm, vỏ quả dày 3 mm.
b) Đặc điểm vật hậu
Hiện tƣợng vật hậu là những hiện tƣợng biến đổi chu kì của sinh vật trong năm, hòa cùng một nhịp với khí hậu. Xác định thời kì chín và rơi rụng của quả, hạt có ý ngh a rất lớn đối với việc thu hái hạt giống và đề xuất các biện pháp tái sinh rừng Những biến đổi vật hậu cụ thể đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4: Đặc điểm vật hậu của c y Trà hoa vàng Ba Chẽ
TT Hiện tƣợng vật hậu Thời gian Đặc điểm vật hậu
I Cơ quan sinh dƣỡng
1 Ra chồi, lá non Tháng 2 - 5 Màu tím
II Cơ quan sinh sản
1 Ra nụ Tháng 6 - 9 Mầu hồng
2 Ra hoa Tháng 9 – 2 năm sau Mọc lẻ, mầu vàng
Kết quả theo dõi vật hậu cho thấy: cây Trà hoa vàng bắt đầu ra chồi, lá non vào tháng 2 - 5, ra nụ vào khoảng tháng 6 - 9, ra hoa vào khoảng tháng 9 - 2 và vào khoảng tháng 11 - 5 năm sau thì đậu quả non, trong thời gian này cây vừa có hoa và vừa có quả (bảng 3.4).
Hình 3.6: Cây Trà hoa vàng Ba chẽ Hình 3.7: Cành mang nụ Trà hoa vàng
Hình 3.8: Quả Trà hoa vàng
Hình 3.9: Mặt trƣớc, mặt sau lá Trà hoa vàng
3.2.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố loài cây Trà hoa vàng tại Ba chẽ
Đặc điểm địa hình
Căn cứ khu vực nghiên cứu tôi lập 4 tuyến điều tra và chọn ra 2 tuyến để lập OTC, trên 1 tuyến thì lập 3 OTC, 2 tuyến thì lập đƣợc 6 OTC. Kết quả điều tra từ 6 OTC có loài Trà hoa vàng phân bố, ta thấy một số đặc điểm về địa hình nơi Trà hoa vàng phân bố nhƣ sau:
Khu vực nghiên cứu cây Trà hoa vàng tại huyện Ba chẽ có địa hình dốc bị chia cắt mạnh bởi các dãy núi đất tạo thành các thung lũng hẹp và các con suối, sông lớn nhỏ. Độ cao trung bình của Ba Chẽ từ 300m - 500m so với mực nƣớc biển. Đất có độ dốc lớn, phần lớn trên 20o
. Đặc điểm khí hậu nơi có cây Trà hoa vàng phân bố
Ba Chẽ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng núi nên nóng ẩm mƣa nhiều. Theo số liệu của trạm dự báo và phục vụ khí tƣợng thủy văn Quảng Ninh thì khí hậu Ba Chẽ có những đặc điểm sau:
- Nhiệt độ không khí: Trung bình từ 210C - 230C, về mùa hè nhiệt độ trung bình dao động từ 260C - 280C, nhiệt độ tối cao tuyệt đối đạt tới 37,60C vào tháng 6. Về mùa đông chịu ảnh hƣởng của gió Đông Bắc nên thời tiết lạnh, nhiệt độ trung bình dao động từ 120C - 160C, nhiệt độ tối thấp tuyệt đối vào tháng 1 đạt tới 10C.
- Độ ẩm không khí: Tƣơng đối trung bình hàng năm ở Ba Chẽ là 83%, cao nhất vào tháng 3, 4 đạt 88%, thấp nhất vào tháng 11 và tháng 12 cũng đạt tới 76%. Do địa hình bị chia cắt nên các xã phía Đông Nam huyện có độ ẩm không khí tƣơng đối cao hơn, các xã phía Tây Bắc do ở sâu trong lục địa nên độ ẩm không khí thấp hơn. Độ ẩm không khí còn phụ thuộc vào độ cao, địa hình và sự phân hóa theo mùa, mùa mƣa có độ ẩm không khí cao hơn mùa ít mƣa.
- Mƣa: Lƣợng mƣa trung bình hàng năm khoảng 2.285 mm. Năm có lƣợng mƣa lớn nhất là 4.077 mm, nhỏ nhất là 1.086 mm. Mƣa ở Ba Chẽ phân bố không đồng đều trong năm, phân hóa theo mùa tạo ra hai mùa trái ngƣợc nhau là: Mùa mƣa nhiều và mùa mƣa ít.
+ Mùa mƣa nhiều: Từ tháng 5 đến tháng 10, mƣa nhiều tập trung chiếm 85% tổng lƣợng mƣa cả năm, tháng có lƣợng mƣa nhiều nhất là tháng 7 (490 mm).
+ Mùa mƣa ít: Từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau, lƣợng mƣa rất nhỏ chỉ chiếm 15% lƣợng mƣa cả năm, tháng có lƣợng mƣa ít nhất là tháng 1 (27,4 mm).
- Lũ: Do đặc điểm của địa hình, độ dốc lớn, lƣợng mƣa trung bình hàng năm cao (trên 2.00 mm), mƣa tập trung theo mùa, hệ thống sông suối lƣu vực ngắn, thực vật che phủ rừng thấp, vì thế mùa mƣa kéo dài lƣợng nƣớc mƣa vƣợt quá khả năng trữ nƣớc của rừng và đất rừng thì xuất hiện lũ đầu nguồn gây thiệt hại từ vùng núi đến vùng hạ lƣu theo một phản ứng dây truyền, ảnh hƣởng xấu đến toàn bộ nền kinh tế - xã hội trong khu vực. Mực nƣớc lũ có năm cao 5-6m, lũ mạnh cuốn trôi những gì có trên dòng sông chảy làm tắc giao thông, gây thiệt hại lớn đến tài sản và hoa màu của nhân dân.
- Nắng: Trung bình số giờ nắng dao động từ 1.600 - 1.700 h/năm nắng tập