Những năm trƣớc đây đã có một số công trình nghiên cứu về các loài trong họ Theaceae và trong chi Camellia, nhƣng việc nghiên cứu mới chỉ tập trung vào
một số loài cây lấy lá làm dƣợc liệu, chế biến nƣớc giải khát còn việc nghiên cứu chi Camellia với mục đích phân loại, thống kê, bảo tồn loài, bảo tồn đa dạng sinh học... còn ít, chƣa sâu, chƣa toàn diện. Trong những năm gần đây chi Camellia đã
Ngƣời đầu tiên nghiên cứu chi Camellia ở Việt Nam là L. Pierre, nhà thực vật học nổi tiếng ngƣời Pháp, sau khi nghiên cứu hệ thực vật ở một số nơi nhƣ: Biên Hoà, Hà Tây, và đầu nguồn sông Đồng Nai, năm 1887 ông đã giới thiệu một số loài của chi Camellia trong cuốn: "Flore forestiere de la cochinchine" dƣới tên chi Thea nhƣ: Thea dormoyana, Thea piquetiana, Thea drupifera, Thea caudata...
Năm 1910, nhà thực vật học ngƣời Pháp là Pitard đã nghiên cứu thực vật ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam nhƣ: Hà Nội, V nh Phúc, Hoà Bình và cho ra cuốn: "Flora Générale de L' Indochine" đã giới thệu 3 loài mới đều lấy tên chi Thea đó là:
Camellia tonkinensis dƣới tên Thea tonkinensis, Camellia flava dƣới tên Thea flava,Camellia amplexicaulis dƣới tên Thea amplexicaulis.
Hơn 30 năm sau, vào năm 1943 nhà thực vật học Gagnepain đã nghiên cứu, hệ thống và mô tả chi tiết 30 loài thuộc chi Camellia, nhƣng khi tiến hành so sánh
và đối chiếu với tài liệu của Sealy và Chang thì có một số loài có tên đồng ngh a, nên số loài mà nhà thực vật học Gagnepain công bố chỉ còn lại 28 loài. Ngoài ra, qua các cuộc khảo sát thực vật ở các vùng khác nhau của các chuyên gia thực vật hai nƣớc Việt Nam và Trung Quốc, một số loài mới đƣợc công bố nhƣ: Camellia aurea, Camellia vietnamensis, Camellia indochinensis...
Tháng 2 năm 1923, Alfred Petelot thầy thuốc ngƣời Pháp đã tiến hành thu thập một số loài thực vật của vùng núi Tam Đảo nay trở thành Vƣờn quốc gia Tam Đảo. Dựa trên mẫu vật mang số hiệu 848 lƣu giữ tại phòng tiêu bản thuộc trƣờng đại học California (UC) nhà thực vật ngƣời Pháp Elmer Drew Merrill đã công bố loài mới và đặt tên là Thea petelotii vào năm 1924. Theo luật danh pháp quốc tế, Robert Sealy một nhà thực vật ngƣời Anh đổi thành Camellia petelotii (Merr) Sealy vào năm 1958 trong tác phẩm “Revesion of the genus Camellia”. Đây là loài
Camellia đầu tiên ghi nhận có ở VQG Tam Đảo. (Sealy, 1958).[47]
Từ năm 1990 đến 1998 nhiều cuộc khảo sát của các nhà nghiên cứu thuộc Viện điều tra quy hoạch rừng, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Trong các bảng danh lục có đề cập đến một số loài thuộc chi
Camellia mà các nhà thực vật ngƣời Pháp đã thu đƣợc ở các vùng khác nhau trên lãnh thổ Việt Nam.
Ngoài ra, còn có một số công trình nghiên cứu về các loài trong chi Camellia ở Việt Nam nhƣ sau:
Nghiên cứu của tác giả Ngô Quang Đê bằng phƣơng pháp điều tra theo tuyến đã điều tra phát hiện khu vực phân bố, đặc điểm hình thái, sinh thái của một số loài Trà hoa tại Vƣờn quốc gia Ba Vì – Hà Tây (nay là Hà Nội) đã cho thấy ở Vƣờn quốc gia Ba Vì có hai loài Camellia có triển vọng thuần hóa làm cây cảnh. Phần lớn những loài này đều phân bố ở độ cao trên 600m, nơi có tầng đất dày, xốp ẩm, hơi chua dƣới tán rừng, là các loài sinh trƣởng chậm, chịu bóng nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh nên cần có kỹ thuật tốt. Hơn nữa, tác giả Ngô Quang Đê đã di thực thuần hóa thành công 2 loài: Trà hoa thơm Ba Vì (Camellia vietnamensis) và Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis (Pitard) Cohen Stuart), hai loài này sinh trƣởng phát triển tốt đồng thời cho hoa đẹp vào dịp xuân về. Đó cũng là một trong số rất nhiều loài Trà hoa mà tác giả đã thuần hóa trồng thành công tại vƣờn Trà của mình (Ngô Quang Đê, 1996).[10]
Với nghiên cứu khảo sát điều kiện sống của Trà hoa vàng tại Ba Vì – Hà Tây và Sơn Động – Bắc Giang nhóm tác giả: Ngô Quang Đê, Ngô Quang Hƣng và Lê Sỹ Doanh đã đánh giá đƣợc điều kiện sống cũng nhƣ các đặc điểm hình thái sinh thái đặc trƣng của hai loài Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis (Pitard) Cohen Stuart) và Trà hoa vàng Sơn Động (Camellia euphlebia Merret Sealy var. microphylla) (Ngô Quang Đê và cộng sự, 2009).[13]
Đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh trƣởng của hai loài Camellia hoa trắng và
Camellia hoa vàng tại Vƣờn quốc gia Ba Vì – Hà Tây đã đƣợc hai tác giả Hoàng Minh Chúc (1996)[9] và Bùi Văn Khánh (1996)[20] quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, tác giả mới chỉ dừng lại ở việc điều tra tổ thành loài cây, xác định quan hệ của loài với môi trƣờng sống thông qua yếu tố khí hậu tại khu vực phân bố của loài nghiên cứu.
Năm 1995, Trần Thị Phƣơng Anh (1995)[1] đã nghiên cứu phân loại chi
Camellia ở Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng. Tuy rằng chỉ nghiên cứu ở một địa điểm là
phần nào góp phần vào việc làm chi tiết hơn sự đa dạng của chi Camellia. Cũng vào năm 1995, trong tạp chí: "Di truyền và ứng dụng" PGS.TS. Trần Ninh công bố hai loài Camellia hoa vàng thu đƣợc ở Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng, trong đó loài
Camellia cucphuongensis là loài mới cho khoa học.
Tác giả Lê Xuân Trƣờng (1997)[39] đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh trƣởng của loài Camellia hoa vàng tại Sơn Động – Bắc Giang. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra đƣợc các đặc điểm hình thái, sinh thái cũng nhƣ các điều kiện môi trƣờng tác động trực tiếp tới loài Trà hoa vàng. Tuy nhiên, đề tài chƣa xác định chính xác đƣợc tên khoa học của đối tƣợng nghiên cứu, khả năng ứng dụng thực tiễn cũng nhƣ các biện pháp nhân giống bảo tồn, phát triển bền vững.
Trà hoa vàng (Camellia petelotii) xuất hiện ở núi Tam Đảo, độ cao từ 800m trở lên, khu vực khí hậu á nhiệt đới, nơi có nhiệt độ bình quân năm là 18,2oC, nhiệt độ cao nhất 25,1oC, nhiệt độ thấp nhất - 0,2oC, lƣợng mƣa bình quân năm khoảng 2.630mm, lƣợng mƣa tháng cao nhất 507,8mm, tháng thấp nhất 42mm, độ cao không khí cao từ 82 – 92%, lƣợng bốc hơi thấp (khoảng 561,5mm/ năm). Không có tháng khô, tháng hạn, tháng kiệt. Đất feralit nâu vàng phát triển trên đá mẹ Rhyolit, độ dốc từ 20 – 30o, độ dày tầng đất > 60cm. Đất hơi chua, mùn ở mức trung bình, đạm ở mức trung bình, P2O5 nghèo, K2O dễ tiêu ở mức trung bình. Đất có thành phần cơ giới từ thịt nhẹ đến thịt trung bình, đất ẩm, xốp, tỉ lệ đá lẫn từ 10 – 30%. Trạng thái rừng IVa, trữ lƣợng từ 159,6 – 203,0m3/ha; tổ thành rừng chủ yếu là Phân mã tuyến nổi, Kháo, Trọng đũa, Gội, Re, Trắc vàng…; rừng đƣợc bảo vệ tốt, hầu nhƣ không bị tác động, tổ thành loài khá phong phú. Trà hoa vàng là cây chịu bóng, phân bố ở tầng dƣới của tầng cây cao và có quan hệ mật thiết với các loài Phân mã tuyến nổi, Kháo, Gội, Re, Trâm,…(Đỗ Đình Tiến, 2000).[37]
Cũng theo Đỗ Đình Tiến, khả năng nhân giống bằng hom loài Trà hoa vàng là hiện thực. Khả năng ra rễ của hom phần nào có chịu ảnh hƣởng của việc xử lý chất điều hoà sinh trƣởng, đồng thời chịu ảnh hƣởng rõ rệt của yếu tố mùa vụ lấy hom.
lệ sống, tỉ lệ hom ra rễ và chất lƣợng rễ của hai loại trà nhận thấy rằng Trà hoa vàng Ba vì có khả năng nhân giống bằng hom cao hơn Trà hoa vàng Tam đảo. Các chỉ tiêu cho các thí nghiệm đƣợc tổng hợp nhƣ sau: Trà hoa vàng Tam đảo có 82,7% tỉ lệ hom sống, 50,8% tỉ lệ hom ra rễ và chỉ số ra rễ là 10,12%. Kết quả tƣơng ứng cho Trà hoa vàng Ba vì nhƣ sau: 84,76%; 58,73% và 15,34%.
Chƣơng 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu.
- Xây dựng đƣợc cơ sở dữ liệu ADN mã vạch Trà hoa vàng loài
C.chrysantha;
- Xác định đƣợc một số đặc điểm lâm học Trà hoa vàng tại khu vực Ba Chẽ; - Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phƣơng pháp giâm hom; Nhằm phục vụ công tác bảo tồn và phát triển loài thực vật quý hiếm này.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
- Đối tƣợng: Cây Trà hoa vàng tại huyện Ba chẽ, tỉnh Quảng Ninh. - Vật liệu: Cành bánh tẻ của cây Trà hoa vàng.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thu mẫu: tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh
- Địa điểm bố trí thí nghiệm: Vƣờn ƣơm trƣờng Cao đẳng Nông lâm Đông Bắc – Quảng Ninh.
2.4. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc các mục tiêu, các nội dung nghiên cứu đƣợc tiến hành bao gồm:
- Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho cây Trà hoa vàng Ba
Chẽ: Thu mẫu, tách chiết AND, điện di kiểm tra độ tinh sạch của AND, thực hiện nhân bản đoạn gen bằng k thuật PCR-RAPD, đọc trình tự, phân tích cơ sở dữ liệu AND mã vạch;
- Nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của Trà hoa vàng (C. chrysantha): Xác định phân bố, đặc điểm sinh trƣởng, đặc điểm sinh học, sinh thái học;
- Nghiên cứu kỹ thuật giâm hom Trà hoa vàng: Ảnh hƣởng của nồng độ các
chất ĐHST thực vật đến tỉ lệ sống, ra rễ; giá thể; loại hom, ánh sáng.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Nghiên cứu mã vạchADN (DNA barcode) cho cây Trà hoa vàng Ba Chẽ
a) Công tác chuẩn bị:
Mẫu phân tích ADN: 06 mẫu lá tƣơi từ 03 cá thể mỗi loài đƣợc thu lấy từ khu rừng tự nhiên Sơn Động (Bắc Giang) và Ba Chẽ (Quảng Ninh). Các mẫu lá đƣợc ký
hiệu lần lƣợt là: CeBG1, CeBG2, CeBG3, CeQN1, CeQN2 và CeQN3. Mẫu lá tƣơi ngay sau đó đƣợc cho vào túi Ziplock chứa silica gel và vận chuyển về Phòng thí nghiệm lƣu trữ ở -800C cho đến khi ADN đƣợc tách chiết.
b) Phân tích mã vạch AND - Tách chiết ADN hệ gen
AND hệ gen đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) của Saghai Maroof et al., 1984. Khoảng 100 mg mô lá đƣợc nghiền trong cối bằng chày sứ trong 600 ml đệm CTAB (2% CTAB, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 8.0). Mẫu đƣợc chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ ở 650C trong bể ổn nhiệt 30 phút, sau đó đƣợc chiết xuất với cùng một thể tích với chlorophorm. Các mẫu đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút. Pha dung dịch đƣợc chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới. ADN đƣợc kết tủa bằng cách thêm 500 l isopropanol lạnh và ly tâm ở 10.000 vòng/phút. ADN tủa sau đó đƣợc rửa sạch bằng cồn 70%. Làm khô và hòa tan ADN trong 50 l đệm TE.
- Khuyếch đại PCR và đọc trình tự
+ Hai vùng ADN lục lạp:
matK (mồi xuôi: 5‟-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3‟;
Mồi ngƣợc: 5‟-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3‟)
rbcL (mồi xuôi: 5‟-GTAAAATCAAGTCCACCACG-3‟;
Mồi ngƣợc: 5‟-GTAAAATCAAGTCCACCGCG-3‟)
+ Một vùng ADN nhân ITS2 (mồi xuôi: 5‟-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3‟; Mồi ngƣợc: 5‟-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3‟)
Các đoạn gen đặc hiệu trên đƣợc khuyếch đại bằng máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Hỗn hợp phản ứng PCR (25l) gồm: 2,5 μl đệm 10X Taq, 2,0 μl hỗn hợp dNTP (2,0 mM), 1,0 μl cho mỗi cặp mồi (10 μM), 0,5 μl cho 5 U/μl Taq DNA polymerase, 1 μl ADN khuôn (50 ng/μl) và H20 cho tổng thể tích đạt là 25l. Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950
C trong 3 phút; (950C: 30 giây, 570C- 620C: 30 giây, 720C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 720C trong 7 phút; bảo quản sản
phẩm PCR ở 040C. Sản phẩm PCR đƣợc đƣợc di trên gel agarose 1,2%. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ Kit của hãng Norgen biotek, Canada. Trình tự nucleotide đƣợc đọc trên máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer (ABI, Foster City, CA, USA).
- Phân tích dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode).
Trình tự thu đƣợc đƣợc xử lý bằng các phần mềm Bioedit version 7.2.5, và công cụ BLAST (Bagic local Alignment Search Tool) trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) tại địa chỉ website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
2.5.2. Nghiên cứu một số đặc điểm Lâm học Trà hoa vàng
- Phƣơng pháp kế thừa tài liệu:
Trong quá trình nghiên cứu đề tài có áp dụng phƣơng pháp kế thừa tài liệu, đề tài sử dụng những kết quả các công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học của Trà hoa vàng. Kế thừa có chọn lọc về điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh.
- Phƣơng pháp điều tra theo tuyến:
Để nghiên cứu đặc điểm phân bố tự nhiên của Trà hoa vàng, đề tài căn cứ vào bản đồ hiện trạng rừng, tiến hành điều tra sơ thám theo tuyến, các tuyến điều tra đi qua những dạng địa hình chính của huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh. Trên các tuyến, nghiên cứu tiến hành quan trắc sự xuất hiện của Trà hoa vàng, tại mỗi vị trí có phân bố cây trà chúng tôi tiến hành xác định ranh giới khu vực điều tra và lập các ô tiêu chuẩn.
Đề tài chọn ô tiêu chuẩn diện tích 1000m2
(20m x 50m)
Nội dung điều tra tại mỗi vị trí có phân bố Trà hoa vàng gồm vị trí tƣơng đối, độ cao, độ dốc mặt đất, kích thƣớc cây Trà hoa vàng, độ tàn che tầng cây cao, nghiên cứu tổ thành loài cây đi kèm bằng phƣơng pháp ô tiêu chuẩn 6 cây của Thomasius, nghiên cứu độ che phủ của các cây bụi thảm tƣơi.
- Điều tra ô tiêu chuẩn:
Khu vực đƣợc chọn phải mang tính chất đại diện, OTC cố định đƣợc đặt tại các vị trí có tính đại diện cao cho rừng. Địa hình trong ô tƣơng đối đồng nhất, cây
rừng phân bố tƣơng đối đồng đều, sinh trƣởng bình thƣờng, OTC không đƣợc đặt vắt qua khe, qua đỉnh hay qua đƣờng mòn, diện tích OTC đƣợc cải bằng tùy theo độ dốc nơi đặt ô.
- Phƣơng pháp lập OTC:
OTC đƣợc lập bằng thƣớc dây và địa bàn cầm tay với sai số khép kín ≤ 1/200, diện tích ô thiêu chuẩn đƣợc xác định là 1000 m2 (20m x 50m). Căn cứ vào điền kiện địa hình và mục đích nghiên cứu đề tài lập 6 ô tiêu chuẩn nơi có Trà hoa vàng phân bố.
- Phƣơng pháp điều tra cây:
Cây tiêu chuẩn đƣợc chọn để đo đếm các chỉ tiêu nhƣ: Hình thái, thân, rễ, lá, hoa, quả và lấy hom để nhân giống vô tính.... cây tiêu chuẩn điển hình đƣợc xác định theo nguyên tắc dƣới đây:
+ Cây tiêu chuẩn phải có đặc trƣng cần nghiên cứu.
+ Cây tiêu chuẩn có cấu trúc, hình thái thân thẳng đẹp, có sức sinh trƣởng tốt. Dung lƣợng điều tra cho các phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể: Do có nhiều chỉ tiêu để nghiên cứu đặc tính sinh vật học nên một phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể có thể là phù hợp cho nội dung nghiên cứu này nhƣng không phù hợp cho nội dung nghiên cứu khác. Do đó phải sử dụng nhiều phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể khác nhau nên dung lƣợng mẫu quan sát cho từng phƣơng pháp cũng khác nhau, nhƣng đều phải đảm bảo độ tin cây cần thiết của phƣơng pháp nghiên cứu đặt ra, về nguyên tắc thì: Dung lƣợng mẫu quan sát n ≥ 30 rút ngẫu nhiên không lặp.
- Điều tra tầng cây cao:
Tầng cây cao theo quan điểm lâm học đó là những cây có tán tham gia vào tầng tán rừng, có D1.3 ≥ 6 cm.
Các chỉ tiêu đo đếm tầng cây cao:
+ Đo D1.3 bằng thƣớc kẹp kính có khắc vạch tới cm.
+ Đo Hvn, HDC, DT bằng sào đo cao. Về các chỉ tiêu D1,3, Hvn, HDC, DT và đánh
giá phẩm chất từng cây. Kết quả ghi vào biểu điều tra tầng cây cao. - Biểu điều tra tầng cây tái sinh:
25 m2, kích thƣớc 5m x 5m. Trong các ODB tiến hành đo đếm số lƣợng cá thể, kích thƣớc, tình hình sinh trƣởng, nguồn gốc tái sinh của các cây thân gỗ. Kết quả điều tra đƣợc ghi vào biểu điều tra cây tái sinh.
- Điều tra cây bụi thảm tƣơi: