Nghiên cứu mã vạchADN (DNA barcode) cho cây Trà hoa vàng Ba Chẽ

a) Công tác chuẩn bị:

Mẫu phân tích ADN: 06 mẫu lá tƣơi từ 03 cá thể mỗi loài đƣợc thu lấy từ khu rừng tự nhiên Sơn Động (Bắc Giang) và Ba Chẽ (Quảng Ninh). Các mẫu lá đƣợc ký

hiệu lần lƣợt là: CeBG1, CeBG2, CeBG3, CeQN1, CeQN2 và CeQN3. Mẫu lá tƣơi ngay sau đó đƣợc cho vào túi Ziplock chứa silica gel và vận chuyển về Phòng thí nghiệm lƣu trữ ở -800C cho đến khi ADN đƣợc tách chiết.

b) Phân tích mã vạch AND - Tách chiết ADN hệ gen

AND hệ gen đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) của Saghai Maroof et al., 1984. Khoảng 100 mg mô lá đƣợc nghiền trong cối bằng chày sứ trong 600 ml đệm CTAB (2% CTAB, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 8.0). Mẫu đƣợc chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ ở 650C trong bể ổn nhiệt 30 phút, sau đó đƣợc chiết xuất với cùng một thể tích với chlorophorm. Các mẫu đƣợc ly tâm ở 10.000 vòng/phút. Pha dung dịch đƣợc chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới. ADN đƣợc kết tủa bằng cách thêm 500 l isopropanol lạnh và ly tâm ở 10.000 vòng/phút. ADN tủa sau đó đƣợc rửa sạch bằng cồn 70%. Làm khô và hòa tan ADN trong 50 l đệm TE.

- Khuyếch đại PCR và đọc trình tự

+ Hai vùng ADN lục lạp:

matK (mồi xuôi: 5‟-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3‟;

Mồi ngƣợc: 5‟-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3‟)

rbcL (mồi xuôi: 5‟-GTAAAATCAAGTCCACCACG-3‟;

Mồi ngƣợc: 5‟-GTAAAATCAAGTCCACCGCG-3‟)

+ Một vùng ADN nhân ITS2 (mồi xuôi: 5‟-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3‟; Mồi ngƣợc: 5‟-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3‟)

Các đoạn gen đặc hiệu trên đƣợc khuyếch đại bằng máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Hỗn hợp phản ứng PCR (25l) gồm: 2,5 μl đệm 10X Taq, 2,0 μl hỗn hợp dNTP (2,0 mM), 1,0 μl cho mỗi cặp mồi (10 μM), 0,5 μl cho 5 U/μl Taq DNA polymerase, 1 μl ADN khuôn (50 ng/μl) và H20 cho tổng thể tích đạt là 25l. Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950

C trong 3 phút; (950C: 30 giây, 570C- 620C: 30 giây, 720C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 720C trong 7 phút; bảo quản sản

phẩm PCR ở 040C. Sản phẩm PCR đƣợc đƣợc di trên gel agarose 1,2%. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ Kit của hãng Norgen biotek, Canada. Trình tự nucleotide đƣợc đọc trên máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer (ABI, Foster City, CA, USA).

- Phân tích dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode).

Trình tự thu đƣợc đƣợc xử lý bằng các phần mềm Bioedit version 7.2.5, và công cụ BLAST (Bagic local Alignment Search Tool) trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) tại địa chỉ website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.