- Phát hiện HCV-RNA: có 2 kỹ thuật chính
+ PCR: xác định RNA của HCV, độ nhạy và độ khuyếch đại rất lớn. Real time PCR định l−ợng HCV-RNA độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Ph−ơng pháp DNA nhánh hoá (bDNA) định l−ợng HCV-RNA độ nhạy kém PCR.
- Năm 1985, Tiến sỹ Kary Mulli đã phát minh ra ph−ơng pháp khuyếch đại gen (PCR – Polymerase Chain Reaction) và nhanh chóng đ−ợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh y học do có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất lớn. Kỹ thuật PCR cho phép phát hiện bằng cách khuyếch đại chọn lọc một đoạn acide nucleic (RNA hoặc DNA) rất nhỏ mà bằng các kỹ thuật thông th−ờng khác không phát hiện đ−ợc [6,46].
Nguyên lý của phản ứng PCR: PCR là ph−ơng pháp invitro để tổng hợp một đoạn DNA cần thiết d−ới sự xúc tác của polymerase DNA bằng việc kéo dài các đoạn mồi (primer) oligonucleotide bổ trợ với phần đầu 3’ của đoạn DNA cần đ−ợc tổng hợp trên nguyên tắc kết hợp bổ sung đôi base: Guanosine và Cytosine, Adenine và Thymine.
Vấn đề cơ bản của kỹ thuật PCR là việc chọn đoạn mồi. Virus viêm gan C có nhiều biến chủng di truyền do đó đoạn mồi đ−ợc chọn cần thiết bổ trợ cho đoạn nucleotide ổn định và chung nhất cho tất cả các genotype. Vùng 5’- UTR không phiên mã (5’ untranslated region) gồm khoảng 324 – 341
nucleotide trong bộ gen của virus là đoạn ổn định nhất giữa các chủng loại khác nhau đ−ợc chọn làm đoạn gen đích để sao chép khuyếch đại.
- Kỹ thuật PCR có −u điểm là độ nhạy cao chỉ cần một l−ợng mẫu huyết thanh hoặc tế bào gan rất nhỏ, kỹ thuật thực hiện nhanh.
Đối với viêm gan virus C kỹ thuật PCR áp dụng chẩn đoán sớm, xác định HCV-RNA là chỉ điểm sớm nhất nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR sau 2 tuần phơi nhiễm. PCR phát hiện các tr−ờng hợp nhiễm virus khi kháng thể anti- HCV ch−a hình thành ở những ng−ời huyết thanh âm tính, khi đó PCR d−ơng tính khẳng định nhiễm trùng thực sự do HCV, ng−ợc lại trong tr−ờng hợp PCR âm tính cho thấy có những ng−ời chỉ có kháng thể đặc hiệu với HCV nh−ng không mang virus, không lây nhiễm. Ngoài ra ng−ời ta còn sử dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu lây truyền virus mẹ sang con, theo dõi tác dụng điều trị và nghiên cứu các đặc tính di truyền sinh học của các biến chủng virus, xác định kiểu gen của HCV.
1.6.3.1 Định tính HCV-RNA bằng kỹ thuật PCR
Để phát hiện HCV bằng kỹ thuật PCR thì cần một giai đoạn chuyển RNA thành cDNA (Complementary Deoxyribonucleic Acid-DNA bổ sung) nhờ các enzyme phiên mã ng−ợc (Reverse Transcriptase – RT). Sau đó dùng một đoạn DNA đặc hiệu làm mồi để xác định DNA đích và khuyếch đại đoạn DNA đích lên nhiều lần. Kỹ thuật PCR phát hiện RNA của HCV là một bằng chứng về sự có mặt của HCV.
−u điểm của ph−ơng pháp RT-PCR có độ nhạy cao, trong điều kiện tối −u chỉ cần có 100 bản sao/1ml huyết thanh có thể phát hiện đ−ợc bằng ph−ơng pháp này. Kỹ thuật PCR t−ơng đối phức tạp, đắt tiền, chỉ thực hiện đ−ợc trong phòng thí nghiệm tiêu chuẩn [46,49,54].
1.6.3.2 Định l−ợng HCV-RNA
- Năm 1991 Holland và cs đã phát hiện chức năng 5’-3’ exonuclease của
Taq polymerase, Oee (1993), Bassler (1995), Livak (1995) đã phát hiện các loại mẫu dò có khả năng thực hiện phản ứng chuyển năng l−ợng huỳnh quang FRET (Fluorescent energy transfer) và cùng với sự phát triển thiết bị máy móc của các công ty nh− Perkin Elmer, Idaho Technologies ... đã hình thành ph−ơng pháp định l−ợng virus Real time PCR. Với ph−ơng pháp PCR thông th−ờng chỉ có tính chất định tính, để cần biết số l−ợng các hạt virus (copy numbers) trong 1ml máu bệnh nhân dùng kỹ thuật Real time PCR.
Nguyên lý của Real time PCR: Cần có hoá chất có khả năng phát huỳnh quang nh− SYBR Green I, Ethidium bromide, các mẫu dò (probe) có gắn chất phát huỳnh quang nh− fluorescein, Tamra ở 2 đầu mút. Trong phản ứng, nếu có sự nhân lên của DNA đích thì chất này sẽ liên kết với DNA đích đó và bắt đầu phát tín hiệu huỳnh quang. Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ đ−ợc các đầu dò của máy luân nhiệt real time thu nhận và xử lý. Khi c−ờng độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu v−ợt qua đ−ờng tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng thì mẫu đ−ợc xem là (+) và ng−ời ta lấy thời điểm v−ợt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ng−ỡng – Ct) để so sánh với một đ−ờng cong (Standard curve) đ−ợc xây dựng từ chu kỳ ng−ỡng của các mẫu chuẩn đã biết tr−ớc nồng độ mà suy ra số l−ợng DNA mẫu đ−a vào phản ứng.
−u điểm của Real time PCR: Độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả đ−ợc phân tích ngay trong lúc phản ứng đang chạy nên không bị nhiễm sản phẩm từ ngoài vào, kết quả thu đ−ợc nhanh hơn nh−ng lại đ−ợc kiểm soát tốt hơn. Không cần các b−ớc sau PCR nh− điện di hay lai phân tử. Đây là ph−ơng pháp đắt tiền, đòi hỏi ng−ời có trình độ chuyên môn thực hiện và phân tích kết quả. Kỹ thuật Real time PCR để định l−ợng HCV đ−ợc áp dụng từ những năm 1996. Kỹ thuật này còn cho phép đáp ứng các nhu cầu khác trong chẩn đoán bệnh viêm gan virus nh− xác định genotype, phân tích các đột biến kháng thuốc.
1.6.3.2.2 Định l−ợng HCV-RNA bằng kỹ thuật bDNA(Branched Deoxyribonucleic Acid technology).
- Dựa trên khả năng lai ghép của các oligonucleotide gắn trên giếng với HCV-RNA và một đoạn DNA. Cộng hợp Alkaline phosphatase gắn đoạn mồi kết hợp đặc hiệu với bDNA. Sau đó thêm cơ chất vào giếng, cơ chất phản ứng với Alkaline phosphatase phát hiện phức hợp lai ghép. Kỹ thuật có độ chính xác cao nh−ng độ nhạy thấp khoảng 200.000 bản sao/1ml huyết thanh [33].
1.6.3.3 Xác định genotype của virus viêm gan C
- Các genotype và subtype đ−ợc xác định trên thế giới đ−ợc chia thành 6 genotype chính từ HCV1 đến HCV6 và mỗi genotype lại đ−ợc chia thành nhiều subtype khác nhau nh− 1a, 1b …. Các genotype đã đ−ợc xác định dựa trên việc phân tích trình tự nucleotide của một phần hệ gen 5’-UTR, vùng C, vùng E1 và vùng NS5B [46,38,70].
- Xác định genotype HCV gồm nhiều ph−ơng pháp đã đ−ợc phát triển: + Giải trình tự (sequencing)
+ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): xác định tính đa dạng độ dài các đoạn cắt giới hạn, ít áp dụng cho chẩn đoán chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu.
+ Lai phân tử: lai ghép sản phẩm RT PCR với mồi đặc hiệu type.
+ Real time PCR (PCR nhân bội đoạn gen đặc hiệu type): real time RT PCR sử dụng TaqMan probe đặc hiệu type.
+ Huyết thanh học (sử dụng kỹ thuật đặc hiệu type), ph−ơng pháp này độ nhạy không cao.
Phần lớn các kỹ thuật trên đều chọn trình tự nucleotide khuôn là vùng 5’ không mã hoá (5’UTR), kết hợp với một số vùng khác nh− vùng “lõi” (core) mã hoá protein lõi hay vùng NS5B mã hoá polymerase của HCV.