3. Ý nghĩa của luận văn
2.4.2. Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen
2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt phấn
Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray database (http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/).
Sử dụng mẫu hạt phấn lúa để tiến hành phân tích lựa chọn các gen biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu. Gen chuyên biệt hạt phấn là những gen biểu hiện duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc.
2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Sử dụng bộ kit bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene để tách chiết DNA tổng số từ hạt phấn lúa. Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất (https://www.qiagene.com/dna/geneomic- dna/dneasy- plant-mini-kit). Các bước tiến hành như sau:
- Bao phấn lúa được nghiền bằng máy TissueLyserll trong 30 giây.
- Bổ sung 400 µl dung dịch AP1 (10mM Tris – HCl pH8.0; 1mM EDTA pH8.0) và 4 µl RNase A. Mẫu được trộn đều và ủ ở 65oC trong 10 phút.
14
- Bổ sung 130 µl AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút.
- Ly tâm mẫu ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 2 phút.
- Chuyển cột lọc sang ống mới và bổ sung 650 µl dung dịch AW1, ly tâm
2 phút ở tốc độ 8,000 vòng/phút.
- Tiếp đến bổ sung 500 µl dung dịch AW2, ly tâm 1 phút ở tốc độ 8,000 vòng/phút.
- Hòa tan DNA bằng 100 µl dung dịch TAE để sử dụng cho nghiên cứu.
2.5.3. Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR
Vùng promoter nằm phía 5’ trước mã mở đầu ATG của gen được khuyếch đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp mồi đặc hiệu RMP (Bảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR STT
1 Nước khử ion
2 MgSO4 (25mM)
3 dNTPs (10mM)
4 Mồi xuôi (10pmol/µl)
5 Mồi ngược (10pmol/µl)
6 KOD enzyme
7 KOD plus buffer ( 1Unit/ µl)
8 DNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl)
Tổng thể tích
Phản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được thực hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min sử dụng cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự adapter attB1 và attB2; bước 2, sử dụng 10 µl
sản phẩm PCR ở bước 1 làm DNA khuôn, thực hiện phản ứng ở 25 chu kỳ theo trình tự như sau: 5 chu kỳ đầu 94oC/15s, 45oC/30s và 72oC/2min ; 20 chu kỳ sau 94oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min.
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng kit tinh sạch HiGene PCR purification của hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dòng.
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của hãng Solgenet gồm các bước sau:
- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích.
- Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.
- Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pDONR201 bằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng + DNA (10ng/ul): 2 µl + Vector (75ng/ul): 1 µl + BP clonase enzyme: 1 µl Tổng số: 4 µl - Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr download by : skknchat@gmail.com
16
- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút
- Biến nạp vào E.coliDH5α.
Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng 2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E.coliDH5α. theo phương pháp shock nhiệt ở 42oC.
- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -80oC đặt trên đá
- Trộn 2 µl DNA vào 100 µl E.coliDH5α.
- Đặt trên đá 30 phút
- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s
- Bổ sung 900 µl môi trường LB lỏng
- Nuôi lắc ở 37oC trong 1h
- Cấy trải 100 µl dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh chọn lọc kanamycin.
- Nuôi qua đêm ở 37oC.
2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phương
pháp và thành phần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử dụng enzyme
Taq DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở
30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb. Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid
Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi trường LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp. Tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng và thu tế bào để tách plasmid.
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 M NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.
- Ly tâm 7000 vòng/phút thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của dịch khuẩn.
- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.
- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf mới.
18
- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần.
- Làm khô mẫu trong box 30 phút.
- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.
- Bổ sung RNase
- Ủ ở 370C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.5.9. Phương pháp định lượng DNA
Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 0,8%.
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Cách tiến hành
- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X
- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 50oC.
- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel.
- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm
lược và để yên cho gel đông lại.
- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏi bản gel.
- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl mẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel.
-Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng
điện 110V trong thời gian 30 phút.
- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.
- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 5 phút.
- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.
2.5.10. Phương pháp xác định trình tự
Để kiểm tra hiệu quả tách dòng RMP promoter, chúng tôi gửi giải trình tự gen. Trình tự gen được kiểm tra bằng các phần mềm Bioedit, NCBI/Blast….
2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS
Promoter RMP sau khi tách dòng thành công sẽ được chuyển vào vector biểu hiện pKGWFS7 có chứa gen chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR clonase. Toàn bộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Invitrogene. Trình tự promoter sẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway. Các bước tiến hành như sau:
- Thành phần phản ứng: + pDOR201-RMP (25ng/ul): 1 µl + pKGWFS7 (50ng/ul): 1 µl + LR clonase enzyme: 1 µl + Nước cất khử ion: 1 µl Tổng số: 4 µl -Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr
-Bổ sung 0,5 µl proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút
20
- Biến nạp vào E.coliDH5α.
-
Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR
Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coliDH5α bằng phương pháp shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt hiệu (như trình bày ở mục trên). Tế bào E.coliDH5α tái tổ hợp được tách plasmid và biến nạp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng GV3101 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 37oC để sử dụng cho chuyển gen.
- Phân tích yếu tố CRE và thiết kế vector chuyển gen
Trình tự promoter được scan bằng phần mềm PLACE (https://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.php?page=URL1100876009) để xác định các CRE có mặt trên vùng promoter. Tiếp đến vùng promoter được khuếch đại bằng PCR.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít sau đó được cắt thành từng phần có độ dài khoảng 300-500 bp bằng enzyme. Các đoạn promoter sau đó gắn với gen
chỉ thị GUS (Hình 2.3). Promoter được đưa vào vector nhân dòng pDONR201 trong E.coliDH5a sau đó được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự gen. Promoter sau đó được chuyển sang vector chuyển gen pKGWFS7 bằng phương pháp Getway và chuyển vào trong cây Arabidopsis bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens GV3101.
Hình 2.3. Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE 2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu giữ -80oC.
- Trộn 4 µl DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến. Nhúng nhanh vào Nitơ lỏng.
- Chuyển sang 37oC trong 5 phút.
- Bổ sung 900 µl LB lỏng, nuôi lắc ở 28oC, 200 vong/phút, 4hr.
- Cấy trải 100 µl dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc.
- Nuôi ở 28oC từ 3 - 4 ngày.
- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR.
2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis
Phương pháp được tiến hành theo Clough (1998) [19].
2.5.13.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium: dung dịch chứa Agrobacterium (5% sucrose và 500 µl /lit chất hoạt động bề mặt Slwet L-77). Sucrose và chất hoạt động bề mặt rất quan trọng đối với sự thành công của phương pháp nhúng hoa.
22
- Lấy chủng khuẩn từ tủ lưu giữ và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 100mg/l đối với chủng A.tumerfaciens mang vector chuyển gen, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ.
- Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 10ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn kanamycin 50mg/l. Bình nuôi lỏng
được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC nuôi qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 vong/phút trong điều kiện 28oC. Dịch khuẩn thu được có OD 260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp.
2.5.13.2. Biến nạp gen
Nhúng toàn bộ cụm hoa của cây Arabidopsis vào trong môi trường có chứa
vi khuẩn trong 30 giây. Cây chuyển gene được tiếp tục nuôi trong điều kiện 25oC 18h chiếu sáng/ngày đến khi thu hoạch quả.
2.5.13.3. Chọn lọc cây chuyển gen
Hạt thu từ cây chuyển gen được chọn lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin 50mg/l. Cây chuyển gene kháng kháng sinh được chuyển ra trồng và phân tích.
2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter
Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa. Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β- glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9].
Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gen chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X- Gluc theo phương pháp của Jefferson (1987).
1. Ngâm mô trong dung dịch nhuộm. Ống microfuge hoạt động tốt cho các mẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn.
2. Hút chân không thâm nhập nhanh.
3. Ủ mô qua đêm ở 37oC.
4. Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi nhận rõ màu xanh lam đặc trưng . Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33].
Sự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách từ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit (QIAGEN,
Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:
5’- TTCGATAACGTGCTGATGG-3’ và GUS-R: 5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’.
PCR theo chu trình nhiệt 94oC/2 phút, 30 chu kỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%.
24
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE
Trình tự promoter RMP được phân tích dựa trên phần mềm dự đoán Plant
Cis-acting Regulator DNA elements (PLACE) (Higo và cs. 1999). Dựa trên kết quả phân tích, vị trí của các yếu tố CRE sẽ được đánh dấu trên trình tự của promoter (phụ lục 1). Kết quả cho thấy có rất nhiều yếu tố CRE được phát hiện trên vùng promoter RMP. Các CRE có vai trò và chức năng khác nhau được chia thành các nhóm chức năng (Bảng 3.1 và 3.2). Trong đó có rất nhiều CRE xuất hiện phổ biến trên tất cả các vùng promoter (Bảng 3.1). Trong đó, sáu CRE phổ biến nhất như ACGTATERD1, ARR1AT, CAATBOX1, GATABOX, MYBCORE và DOFCOREZM. Tần số xuất hiện của các CRE được thể hiện ở biểu đồ hình 3.1.