3. Ý nghĩa của luận văn
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid
Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi trường LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp. Tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường LB lỏng và thu tế bào để tách plasmid.
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 M NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.
- Ly tâm 7000 vòng/phút thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của dịch khuẩn.
- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.
- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf mới.
18
- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn, làm lại hai lần.
- Làm khô mẫu trong box 30 phút.
- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.
- Bổ sung RNase
- Ủ ở 370C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.