3. Ý nghĩa của luận văn
2.5.9. Phương pháp định lượng DNA
Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 0,8%.
Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Cách tiến hành
- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X
- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 50oC.
- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel.
- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm
lược và để yên cho gel đông lại.
- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra khỏi bản gel.
- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl mẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel.
-Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng
điện 110V trong thời gian 30 phút.
- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.
- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng 5 phút.
- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.