3. Ý nghĩa của luận văn
3.4. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen RMP1del::GFP/GUS
Để đánh giá vai trò của các CRE, chúng tôi tiến hành cắt bỏ vùng promoter từ -623 đến -1.403 bp tính từ điểm khởi đầu sao chép (ATG) và thiết kế vector mang gen chỉ thị GUS. Vùng promoter từ -1 đến -623 được khuếch đại bằng PCR và đưa vào vector nhân dòng pDONR201 theo phương pháp Gateway. Promoter được đưa vào vector pDONR201 bằng phản ứng BP sau đó biến nạp vào chủng E.coliDH5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1del-F/attB2. Kết quả điện di trên gel thu được 3 khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,63 kb tương ứng với kích thước mong muốn của promoter (Hình 3.6). Để kiểm tra kết quả tách dòng, nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 2, tách plasmid và gửi đi giải trình tự gen tại công ty COSMOGENETECH (http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) của Hàn Quốc. Kết quả giải trình tự gen được kiểm tra trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Kết quả cho thấy toàn bộ trình tự promoter RMP1del tách dòng trùng khớp với trình tự promoter của gen trên ngân hàng gen (phụ lục 2).
Từ các kết quả này chứng tỏ đã tách dòng thành công promoter RMP1del, ký hiệu là pDORMP1del. Để đánh giá khả năng hoạt động, promoter RMP1del được gắn vào vector chuyển gen pKGWFS7 theo phương pháp Gateway. Bằng phản ứng LR toàn bộ trình tự promoter được chèn vào phần ccdB giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 để điều khiển gen chỉ thị GFP và GUS hoạt động. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp bằng PCR cho thấy, cả 4 khuẩn lạc đều dương tính với promoter RMP1del khi sử dụng cặp mồi RMP1del-F và RMP1del-R (Hình 3.6), điều đó chứng tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1del với vector pKGWFS7 đã thành công. Ký hiệu lần lượt là pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-
RMP1del ::GFP/GUS (A) và vector chuyển gen pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (B)