3. Ý nghĩa của luận văn
2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter
Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa. Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β- glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9].
Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của gen chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X- Gluc theo phương pháp của Jefferson (1987).
1. Ngâm mô trong dung dịch nhuộm. Ống microfuge hoạt động tốt cho các mẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn.
2. Hút chân không thâm nhập nhanh.
3. Ủ mô qua đêm ở 37oC.
4. Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi nhận rõ màu xanh lam đặc trưng . Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50% ethanol [33].
Sự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được tách từ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit (QIAGEN,
Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:
5’- TTCGATAACGTGCTGATGG-3’ và GUS-R: 5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’.
PCR theo chu trình nhiệt 94oC/2 phút, 30 chu kỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%.
24
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE
Trình tự promoter RMP được phân tích dựa trên phần mềm dự đoán Plant
Cis-acting Regulator DNA elements (PLACE) (Higo và cs. 1999). Dựa trên kết quả phân tích, vị trí của các yếu tố CRE sẽ được đánh dấu trên trình tự của promoter (phụ lục 1). Kết quả cho thấy có rất nhiều yếu tố CRE được phát hiện trên vùng promoter RMP. Các CRE có vai trò và chức năng khác nhau được chia thành các nhóm chức năng (Bảng 3.1 và 3.2). Trong đó có rất nhiều CRE xuất hiện phổ biến trên tất cả các vùng promoter (Bảng 3.1). Trong đó, sáu CRE phổ biến nhất như ACGTATERD1, ARR1AT, CAATBOX1, GATABOX, MYBCORE và DOFCOREZM. Tần số xuất hiện của các CRE được thể hiện ở biểu đồ hình 3.1. Trong các promoter, yếu tố ACGTATERD1 xuất hiện với 16 lần trên vùng promoter RMP5, 12 lần trên RMP1 và RMP3, 8 lần trên RMP 2, RMP4 và RMP8 và 4 lần trên RM9, RMP10. ARR1AT xuất hiện 26 lần trên RMP2, 24 lần trên RMP3, 22 lần trên RMP10, RMP5 (21), RMP9 (18), RMP6 (14), RMP7 (13), RMP1 (12), RMP4 (4). Hộp CAATBOX1 xuất hiện 34 lần trên RMP2, 22 lần trên RMP3, RMP10, RMP1 (18), RMP 5 (16), RMP7 (16), RMP9 (12), RMP6 (11), RMP8 (7), RMP4 (5). Hộp GATA xuất hiện 30 lần trên RMP1, RMP5 (20), các RMP6, 7,9 và RMP10 xuất hiện từ 15 đến 17 lần. Yếu tố MYBCORE xuất hiện 10 lần trên promoter RMP5, 6 lần trên RMP3, 4 và RMP10, 4 lần trên RMP1, RMP2 và RMP8. Yếu tố DOFCOREZM xuất hiện từ
31 đến 56 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMP10, từ 10 đến 25 lần trên RMP3, RMP4, RMP8, RMP9.
Ngoài các CRE xuất hiện với tần số lớn nêu trên, kết quả phân tích phát hiện 11 CRE liên quan đến tính biểu hiện chuyên biệt ở mô, cơ quan (Bảng 3.2). Trong
đó, một số CRE chuyên biệt hạt phấn như GTGANTG10, POLLEN1LELAT52,
SITEIIATCYTC, 5659BOXLELAT5659. Promoter RMP1, RMP2 và RMP3 có từ 10 đến 17 trình tự GTGANTG10, các promoter khác từ 5 đến 8 trình tự. Tương tự, yếu tố POLLEN1LELAT52 xuất hiện với tần số từ 13 đến 15 lần trên RMP2, RMP5, RMP6 và RMP10. Các CRE SITEIIATCYTC, 5659BOXLELAT5659 chỉ thấy xuất hiện trên RMP4, RMP8 và RMP10 (hình 3.2). Để đánh giá vai trò của CRE đối với khả năng hoạt động của promoter, chúng tôi lựa chọn gen RMP1 để tiến hành phân tích chi tiết.
26
Bảng 3.1. Các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP
Yếu tố CREs Trình tự (5’-3’)
ACGTATERD1 ACGT
ARR1AT NGATT (N=G/A/C/T)
CAATBOX1 CAAT
CURECORECR GTAC
DOFCOREZM AAAG
GATABOX GATA
GT1CONSENSUS GRWAAW (R=A/G;
W=A/T)
MYBCORE CNGTTR
MYCCONSENSUSAT CANNTG (N=A/T/G/C)
27
Bảng 3.2. Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP
Yếu tố CREs Trình tự (5’-3’)
AACACOREOSGLUB1 AACAAAC
CACTFTPPCA1 YACT (Y=T/C)
EBOXBNNAPA CANNTG (N=A/G/C/T) GTGANTG10 GTGA POLLEN1LELAT52 AGAAA P1BS GNATATNC OSE1ROOTNODULE AAAGAT RHERPATEXPA7 KCACGW (K=G/T; W= A/T) ROOTMOTIFTAPOX1 ATATT RYREPEATBNNAPA CATGCA TAAAGSTKST1 TAAAG
5659BOXLELAT5659 GAAWTTGTGA (W=A/T)
28
Hình 3.1. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP
29
3.2. Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn
Kết quả phân tích database (RiceXPro) ở các giai đoạn từ khi hình thành hoa mầm hoa (inflorescence) đến hình thành vỏ hạt (lemma, palae) cho thấy gen
RMP1 bắt đầu biểu hiện khi bao phấn (anther) được hình thành. Gen biểu hiện mạnh nhất ở giai đoạn bao phấn có kích thước từ 1.5 đến 2.0mm (hình 3.3), không hoặc rất ít biểu hiện các cơ quan khác của cây như hạt, lá (hình 3.4).
Hình 3.3. Biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm RiceEXPro
Ghi chú: inflorescence- hoa, anther-bao phấn, pistil-nhụy, lemma- vỏ trấu
trên, palea- vỏ trấu dưới.
Hình 3.4. Mô phỏng biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm eFP
Ghi chú: Biểu đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện gen tăng dần từ màu vàng đến màu đỏ tương ứng với các giai đoạn phát triển của hoa (inflorescence P1 - P5), hạt (seed S1-S5), lá non (young leaf), lá trưởng thành (mature leaf), rễ cây con (seeding root).
3.3. CRE phổ biến trên vùng promoter RMP1
Kết quả phân tích cho thấy có 80 CRE trên vùng promoter RMP1. Các CRE xuất hiện với tần số và vai trò khác nhau trong điều hòa hoạt động của gen. Trong đó có 6 CRE xuất hiện với tần số lớn từ 12 đến 35 lần. Các CRE tham gia vào các chức năng khác nhau như stress, hocmon, biểu hiện gen,… Trong đó ARR1AT là yếu tố liên kết được tìm thấy trên các promoter của cây lúa và Arabidopsis. Sakai và cộng sự (2000) đã chứng minh ARR1 và ARR2 là các yếu tố phiên mã có vai trò điều hòa quá trình tổng hợp cytokinin. Trên trình tự promoter RMP1 ARR1AT xuất hiện lần lượt 12 lần. CAATBOX chịu trách nhiệm kiểm soát hoạt động chuyên biệt ở mô của gen LegA ở cây đậu ngựa, đồng thời tham gia vào điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis [37]. DOFCEREZM liên kết với protein Dof tham gia điều hòa hoạt động của gen liên quan đến stress, tổng hợp hoocmon và biểu hiện đặc hiệu mô ở cây 1 và 2 lá mầm [49]. DOFCEREZM xuất hiện 15 trên promoter RMP1. GATABOX tham gia điều hòa hoạt động đặc hiệu mô, kiểm soát mức độ biểu hiện gen [48]. CACTFTPPCA1 là thành viên chính tham gia điều hòa hoạt động tổng hợp các bon ở tế bào trung bì (mesophyll). Sharma và cộng sự (2011) phân tích promoter của 40 gen nhận thấy CACTFTPPCA1 là yếu tố phổ biến có mặt ở tất cả các promoter [36]. Kết quả phân tích cho thấy CACTFTPPCA1 xuất hiện 18 lần trên vùng promoter RMP1. EBOXBNNAPA là yếu tố tham gia biểu hiện gen đặc hiệu ở mô của gen tổng hợp phenylpropanoid được chứng minh bởi Stålberg và cộng sự (1996) và Hartmann và cộng sự (2005) [19], [40]. Yếu tố này được phát hiện trên promoter của RMP1 với tần số là 20. Đặc biệt, kết quả phân tích cho thấy hai yếu tố GTGANTG10 và POLLEN1LAT52 kiểm soát biêu hiện chuyên
31
biệt ở hạt phấn và bao phấn là đều có mặt trên promoter RMP1. Trong đó GTGANTG10 xuất hiện với tần số 14 lần trên RMP1, POLLEN1LAT52 với tần số 21 lần trên. Đây là 2 motif quan trọng điều hòa hoạt động chuyên biệt hạt phấn được tìm thấy trên gen g10 ở cây thuốc lá, Lat56, Lat52 ở cây cà chua [16], [31]. Vị trí phân bố của các motif này được thể hiện ở hình 3.5.
Bảng 3.3. Danh sách các CRE phổ biến trên promoter RMP1
STT CREs 1 ARR1AT 2 CAATBOX1 3 CACTFTPPCA1 4 DOFCOREZM 5 EBOXBNNAPA 6 GATABOX
32
STT CREs
7 GTGANTG10
8 POLLEN1LELAT52
Hình 3.5. Tần số xuất hiện các CRE phổ biến (A) và vị trí phân bố của Pollen1LETAT52 và (B) trên promoter RMP1.
33
3.4. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen RMP1del ::GFP/GUS
Để đánh giá vai trò của các CRE, chúng tôi tiến hành cắt bỏ vùng promoter từ -623 đến -1.403 bp tính từ điểm khởi đầu sao chép (ATG) và thiết kế vector mang gen chỉ thị GUS. Vùng promoter từ -1 đến -623 được khuếch đại bằng PCR và đưa vào vector nhân dòng pDONR201 theo phương pháp Gateway. Promoter được đưa vào vector pDONR201 bằng phản ứng BP sau đó biến nạp vào chủng E.coliDH5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1del-F/attB2. Kết quả điện di trên gel thu được 3 khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,63 kb tương ứng với kích thước mong muốn của promoter (Hình 3.6). Để kiểm tra kết quả tách dòng, nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 2, tách plasmid và gửi đi giải trình tự gen tại công ty COSMOGENETECH (http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) của Hàn Quốc. Kết quả giải trình tự gen được kiểm tra trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Kết quả cho thấy toàn bộ trình tự promoter RMP1del tách dòng trùng khớp với trình tự promoter của gen trên ngân hàng gen (phụ lục 2).
Từ các kết quả này chứng tỏ đã tách dòng thành công promoter RMP1del, ký hiệu là pDORMP1del. Để đánh giá khả năng hoạt động, promoter RMP1del được gắn vào vector chuyển gen pKGWFS7 theo phương pháp Gateway. Bằng phản ứng LR toàn bộ trình tự promoter được chèn vào phần ccdB giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 để điều khiển gen chỉ thị GFP và GUS hoạt động. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp bằng PCR cho thấy, cả 4 khuẩn lạc đều dương tính với promoter RMP1del khi sử dụng cặp mồi RMP1del-F và RMP1del-R (Hình 3.6), điều đó chứng tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1del với vector pKGWFS7 đã thành công. Ký hiệu lần lượt là pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-
RMP1del ::GFP/GUS (A) và vector chuyển gen pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (B)
3.5. Vai trò của CRE với khả năng biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn
Để đánh giá vài trò của CRE đối với hoạt động của promoter RMP1 và RMP1del::GFP/GUS vào cây Arabidopsis thaliana thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens. Kết quả thu được 15 cây chuyển gene RMP1 và 20 cây
RMP1del thế hệ T1 sống sót trên môi trường chọn lọc kanamycin. Những cây chuyển gen này được chuyển ra trồng trong chậu đất để tiến hành đánh giá. Để khẳng định sự có mặt của gen chỉ thị GUS trong các cây chuyển gen này tiến hành phân tích ngẫu nhiên 10 cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-F và GUS-R. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy tất cả các cây chuyển gen cấu trúc RMP1 ::GFP/GUS đều cho kết quả dương tính. Trong khi đó chúng tôi thu được 9/10 cây cho kết quả dương tính ở các cây chuyển gen RMP1del (Hình 3.7).
35
Hình 3.7. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR với cặp mồi GUS-F/GUS-R
Ghi chú : M : marker 1kb ; (+) đối chứng dương tính ; (-) đối chứng âm tính ; từ #1 đến #10 : cây chuyển gene mang cấu trúc vector
RMP1 ::BGFP/GUS (A) và vector RMP1del ::GFP/GUS (B).
Phân tích biểu hiện gen GUS ở cụm hoa cho thấy mức độ biểu hiện khác nhau ở các cây chuyển gen RMP1 và RMP1del. Gen GUS biểu hiện mạnh ở hạt phấn khi được điều khiển bởi promoter RMP1 (Hình 3.8C). Ở các cây chuyển gen RMP1edel mức độ biểu hiện của gen GUS yếu hơn (Hình 3.8C). Đồng thời cây đối chứng không chuyển gen thì hạt phấn không biểu hiện màu xanh đặc trưng do không có gen chỉ thị GUS. Mặt khác ở các bộ phận khác như lá, thân của cây được chuyển gen cũng không biểu hiện màu xanh của gen chỉ thị GUS như ở hạt phấn. Kết quả phân tích biểu hiện gen GUS ở cụm hoa của các cây chuyển gen hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích biểu hiện gen RMP1 dựa trên cơ sở dữ liệu heat-map
Hình 3.8. Biểu hiện của gen GUS ở cụm hoa cây chuyển gen Ghi chú : Màu xanh (mũi tên) là biểu hiện của gen GUS
Từ kết quả phân tích biểu hiện gen GUS ở các cây Arabidopsis chuyển gen được điều khiển bởi promoter RMP1del cho thấy khả năng biểu hiện gen giảm đi đáng kể so với promoter RMP1 nguyên vẹn. Điều này cho thấy việc mất đi 780bp từ vị trí -632 đến -1403 tính từ điểm khởi đầu mã hóa (ATG) đã ảnh hưởng đến khả năng kiểm soát biểu hiện gen GUS. Khi loại bỏ vùng promoter nói trên, ngoài một số CRE phổ biến như : ARR1AT, CAATBOX1, CACTFTPPCA1, DOFCOREZM, EBOXBNNAPA, GATABOX,… còn có các CRE đặc hiệu như GTGANTG10 bị mất đi (hình 3.8B) đã làm giảm tín hiệu biểu hiện của gen GUS ở hạt phấn ở cây chuyển gen RMP1del ::GUS (hình 3.8C).
37
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi kết luận :
- Đã sàng lọc được CRE từ 10 gen RMP có biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn
lúa.
- Tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gen mang promoter RMP1del có kích thước 623 bp, ký hiệu là pKG7-RMP1::GFP/GUS và pKG7- RMP1del ::GFP/GUS.
- Chuyển thành công vector chuyển gen vào cây Arabidopsis để đánh giá hoạt động của promoter. Phân tích 9/10 cây chuyển gen RMP1del ::GFP/GUS bằng PCR cho kết quả dương tính với gen GUS.
- Promoter RMP1del mất 780 bp đã làm giảm mức độ biểu hiện của gen do mất một số CRE, trong đó có yếu tố tăng cường khả năng biểu hiện gen ở hạt phấn GTGANTG10.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện về khả năng hoạt động của promoter RMP1del ở cây lúa và vai trò của các CRE đối với khả năng biểu hiện gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng việt
1. Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò của yếu tố điều hòa Cis trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học, 37(3), tr. 370-383.
2. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí công nghệ sinh học, 5(1), tr.118.
3. Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016) “Nghiên cứu hoạt động của promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống chịu arsenic trong cây mô hình Arabidopsis”, tạp chí Công nghệ Sinh học 14(3), tr. 499-505.
AI. Tài liệu tiếng anh
4. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M. (1997), “Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp. 841 - 857.
5. Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun MY,
Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show severe male sterility”,
Plant Breed , 129, pp. 647 – 651.
6. Benfey P. N., Chua N. H. (1990), “The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, 250(4983), pp. 959966.
7. Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp. 1632 -1642.
39
8. Brink RA, MacGillivray JH (1924) Segregation for the waxy character in maize pollen and differential development of the male gametophyte. Am J Bot 11:465–469
9. Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z. (2013), “AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”,
Mol Plant, 6, pp. 1187-1201.
10. Christensen A.H. & Quail P.H. (1996), “Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp. 213 - 218.
11. Clough (1998), “Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-
mediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp. 735 -