2.7.1. Phương pháp đo phổ hấp thụ UV-vis.
Phép đo phổ hấp thụ đƣợc thực hiện trên hệ đo UV-vis đƣợc thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng. Sử dụng phổ hấp thụ để phân tích một số tính chất của mẫu, có độ nhạy cao, mẫu không bị phá hủy. Sử dụng phổ UV-vis để xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của nano vàng ở các điều kiện khác nhau. Nano vàng có tính chất cộng hƣởng plasmon bề mặt nhờ đó có tính hấp thụ các tia bức xạ thích hợp, nên có thể dựa trên các đỉnh hấp thụ UV-vis để xác định sự hình thành hạt nano sau khi chế tạo.
Hình 2.5. Máy quang phổ UV-vis (Dynamica, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
* Quy trình đo phổ hấp thụ
Bật máy, chờ khởi động xong, đặt cho máy ở chế độ đo phổ hấp thụ. Dùng nƣớc cất rửa sạch cuvet thạch anh hai lần và lau khô bằng giấy sạch, bơm dung dịch nano vàng vào cuvet. Sau đó, đặt cuvet chứa dung dịch nano vàng và cuvet chứa nƣớc cất (làm chuẩn) vào máy đo phổ UV-vis để quét phổ. Sau khi đo phổ nền, các mẫu ở những điều kiện khác nhau đƣợc đo và ghi lại phổ. Sau mỗi
phép đo số liệu sẽ đƣợc lƣu giữ dƣới dạng file excel. Dữ liệu phổ hấp thụ đƣợc thu thập trên máy tính và xử lí bằng phần mềm Origin 8.0
2.7.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho phép quan sát đƣợc nhiều chi tiết nano của mẫu nghiên cứu: hình dạng, kích thƣớc hạt, biên các hạt… Sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học.Phƣơng pháp này cho bức ảnh chân thực về kích thƣớc hạt của vật liệu .Môi trƣờng truyền chùm điện tử và đặt mẫu là chân không cao (106
– 109 Torr).
Trong nghiên cứu này, TEM JEOL 1010 (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng) đƣợc sử dụng để khảo sát về hình thái và kích thƣớc của hạt nano vàng sau khi chế tạo. Ảnh TEM là hình ảnh đen trắng phía sau của mẫu, đặc trƣng bởi mật độ điện tử truyền qua ngay dƣới bề mặt. Hình ảnh này đƣợc phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và cuối cùng thu đƣợc trên màn huỳnh quang hoặc camera. Kính TEM có độ phân giải khoảng 3A0 và độ phóng đại từ x50 tới x1.500.000
Hình 2.6. Học viên làm việc trên kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1010, JEOL).
Chuẩn bị mẫu: Mẫu nano vàng sau khi chế tạo đƣợc rung siêu âm sau đó nhỏ lên lƣới đồng (200 mắt) đã phủ màng collodion-cacbon, để khô tự nhiên trƣớc khi đƣa vào quan sát trên máy TEM.
2.7.3. Hển vi điện tử quét ( SEM )
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt vật mẫu bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫuvà giúp quan sát hình thái bề mặt của chúng thông qua các chùm tia điện tử thứ cấp hay tán xạ ngƣợc. Hình ảnh SEM là hình ảnh của mẫu đƣợc vật thể hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Nghiên cứu này sử dụng SEM để quan sát hình thái vi khuẩn tụ cầu và
Hình 2.7. Học viên làm việc trên kính hiển vi điện tử quét (S-4800, Hitachi). Chuẩn bị mẫu: Phép đo đƣợc thực hiện trên kính SEM phát xạ trƣờng (S4800 – Hitachi, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng). Quá trình làm mẫu đƣợc tóm tắt nhƣ sau: nhỏ dung dịch nano vàng đã đƣợc li tâm để cô đặc (10.000 rpm, trong 10 phút) và nhỏ lên bề mặt đế gắn băng dính cacbon, để mẫu khô tự nhiên trong không khí, sau đó hút chân không rồi đƣa vào kính hiển vi điện tử quét để quan sát hình thái bề mặt và phân bố kích thƣớc hạt nano vàng.
2.7.4. Phân tích thành phần (EDX).
Phổ tán xạ năng lƣợng tia X (EDX), hoặc phổ tán sắc năng lượng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn thông qua việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tƣơng tác với các bức xạ.
Phƣơng pháp EDX dựa trên sự tƣơng tác giữa các nguồn tia X kích thích và mẫu cần phân tích. Khi chùm điện tử có năng lƣợng lớn đƣợc chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tƣơng tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử.
Nghiên cứu này sử dụng EDX gắn trên SEM để xác định độ sạch của nano vàng sau khi chế tạo bằng phƣơng pháp điện hóa
Hình 2.8. Thiết bị phân tích EDX (EMAX-Horiba) gắn trên SEMtại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Chuẩn bị mẫu: Quá trình chuẩn bị mẫu hoàn toàn nhƣ chuẩn bị mẫu cho SEM.
2.8. Kết luận
Chƣơng 2 đã mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, các phƣơng pháp phân tích, quy trình chức năng hóa hạt nano vàng với kháng thể. Các thiết bị và phép phân tích hiện đại của các phòng thí nghiệm hàng đầu của Việt Nam, các thiết bị phân tích hiện đại có độ tin cậy và chính xác cao.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nano vàng chế tạo bằng phƣơng pháp điện hóa
Trong nghiên cứu này, hạt nano vàng đã đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp điện hóa. Mẫu sau 2,5 giờ chế tạo đƣợc khảo sát sự hình thành hạt nano vàng bằng cảm quan và phổ UV-vis. Hình 3.1 cho thấy nano vàng đã chế tạo đƣợc có màu đỏ tƣơi [11], [30]. Khác với các phƣơng pháp chế tạo khác, phƣơng pháp này có khả năng tạo ra lƣợng lớn nano vàng từ thanh vàng khối, trong khi đó dung dịch tạo thành hoàn toàn không có chất phản ứng tồn dƣ hay các chất độc hại nào khác.
Hình 3.1. Nano vàng chế tạo từ thanh vàng bằng phương pháp điện hóa
Phân tích phổ hấp thụ UV-vis đối với các loạt mẫu điều chế tại điện áp 9V và nồng độ natri citrate 0,1% cho thấy chúng có đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng khoảng
(Hình 3.2a). Hơn nữa, đỉnh phổ hẹp và không xuất hiện đỉnh phụ, điều này thể hiện rằng kích thƣớc hạt nano vàng hình thành rất tập trung ở một dải kích thƣớc xác định nào đó [30], [31]. Nhƣ vậy, có thể dự đoán rằng mẫu chế tạo trong thời gian 2,5 giờ có kích thƣớc tƣơng đối ổn định.
Hình 3.2. Phổ UV-vis (a) và ảnh TEM hạt nano vàng (b) chế tạo bằng phương pháp điện hóa
Dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua, các hạt nano vàng phân tán rải rác trên vi trƣờng, phân tích cho thấy các hạt có hình cầu, phân bố tƣơng đối rời rạc, không bị kết dính và kích thƣớc nằm trong khoảng 15-18 nm (Hình 3.2b). Các đám hạt nano trên nền có sự tách rời, quan sát thấy rõ ràng các biên hạt, do vậy mẫu có thể dễ dàng phân tách hoặc sử dụng các chất bao bọc thích hợp để ngăn cản sự kết dính của các hạt nano này theo thời gian. Hơn nữa, từ phổ hấp thụ UV-vis đã cho thấy không xuất hiện các đỉnh lạ, hình ảnh TEM cũng cho thấy nền lƣới sạch. Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng, trong sản phẩm nano tạo thành không có các tạp chất. Ngoài ra, công nghệ chế tạo nano vàng bằng phƣơng pháp điện hóa có thể coi là một phƣơng pháp thân thiện với môi trƣờng, phƣơng pháp này tạo ra sản phẩm nano sạch và an toàn, có thể sử dụng trong y sinh học nhƣ chẩn đoán hoặc điều trị [1], [32], [33]. Phƣơng pháp này đã đƣợc tham khảo và biến đổi từ phƣơng pháp chế tạo nano bạc của chính nhóm nghiên cứu, những kết quả nghiên cứu của phƣơng pháp này đã đƣợc công bố trên những Tạp chí quốc
tích thành phần của nano vàng tạo thành, mẫu đã đƣợc chuẩn bị để phân tích trên kính hiển vi điện tử quét độ phân giải cao. Hình 3.3 cho thấy các hạt nano vàng có dạng hình cầu đồng nhất, biên hạt lớn và có kích thƣớc trung bình khoảng 20 nm. Với hình ảnh SEM độ phân giải cao, bức tranh tổng thể về hình thái kích thƣớc hạt trên lƣợng mẫu lớn có thể quan sát và phân tích chi tiết. Đối với mẫu nano vàng đƣợc chuẩn bị để quan sát trên SEM, các hạt sẽ lắng đọng tự nhiên xuống đế sau quá trình ly tâm, cô đặc và sấy khô trƣớc khi đƣa vào kính. Khác với kỹ thuật TEM, mẫu không cần ly tâm mà đƣợc nhỏ trực tiếp hoặc gián tiếp lên lƣới để các hạt có thể bám dính theo tƣơng tác tĩnh điện hay hấp phụ vật lý. Trên thực tế, kính hiển vi điện tử quét hiện đại nhất ngày nay thƣờng có độ phân giải lớn nhất khoảng 1 nm (so với độ phân giải của kính hiển vi điện tử truyền qua là 0,1 nm). Chính vì thế, hình ảnh hạt nano dƣới 20 nm khi quan sát dƣới kính SEM sẽ mờ và biên hạt không rõ ràng bằng hình ảnh khi quan sát dƣới TEM [37], [38]. Điều này có thể lý giải cho sự lớn hơn về kích thƣớc của các hạt nano vàng quan sát bằng SEM so với kích thƣớc hạt khi quan sát bằng TEM [39], [40].
Để đánh giá mức độ “sạch” của nano vàng chế tạo đƣợc, mẫu sau khi quan sát dƣới kính TEM và SEM đã đƣợc phân tích thành phần. Hình 3.4 cho thấy phổ EDX của mẫu nano vàng đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp điện hóa với các đỉnh đặc trƣng ở mức năng lƣợng khác nhau, đỉnh phổ cao nhất ở mức năng lƣợng 2,2 keV đặc trƣng cho lớp M, ngoài ra không xuất hiện các đỉnh phổ của nguyên tử C và O từ thành phần citrate bao bọc bên ngoài nhƣ những nghiên cứu trƣớc đây. Hơn nữa, trên phổ cũng không thấy xuất hiện các đỉnh lạ của các tạp chất (nếu có) trong mẫu phân tích, phổ EDX cũng đã chứng minh độ sạch cao của hạt nano vàng chế tạo đƣợc [39], [41], [42]. Hơn nữa, trƣớc khi phân tích thành phần mẫu đƣợc ly tâm tốc độ cao để tăng nồng độ và lấy phần lắng cặn, do vậy các hạt nano quan sát đƣợc thể hiện sự trung thực của mẫu về hình dạng cũng nhƣ kích thƣớc trong dung dịch sản phẩm nano.
Hình 3.4. Phổ EDX của nano vàng chế tạo bằng phương pháp điện hóa. Ảnh góc trên phải là hình ảnh SEM của vùng phân tích thành phần.
3.2. Phức hợp nano vàng – kháng thể và đặc tính quang
3.2.1 Nồng độ kháng thể gắn với nano vàng và các đặc tính quang
Nhƣ đã đề cập trong phần phƣơng pháp, phức hợp nano vàng – kháng thể hình thành thông qua hấp phụ vật lý. Dung dịch nano vàng gắn kháng thể kháng tụ cầu đƣợc trình bày trong Mục 2.3. Hình 3.5a cho thấy sản phẩm nano vàng tạo thành sau khi gắn kháng thể, có thể thấy rằng các hạt nano vàng không bị kết tủa. Phức hợp này tồn tại ở trạng thái lơ lửng trong dung dịch và sẵn sàng có thể tẩm lên tấm cộng hợp (Hình 3.5b) sử dụng cho của que thử nhanh để thử nghiệm phát hiện vi khuẩn hoặc sử dụng cho các mục đích khác.
Hình 3.5. Phức hợp nano vàng-kháng thể (a) và tạo tấm cộng hợp (b)
Để khảo sát các đặc tính quang cũng nhƣ khả năng tạo vạch màu trong que thử, dung dịch nano vàng đƣợc ủ với kháng thể ở các nồng độ khác nhau, đồng thời đánh giá phức hợp lên thông qua vạch đối chứng của que thử nhanh [43].
Hình 3.6 cho thấy kết quả phổ hấp thụ UV-vis của dung dịch nano vàng trƣớc và sau khi chức năng hóa với kháng thể IgG thỏ kháng vi khuẩn tụ cầu ở những nồng độ khác nhau: 0,5 µg/mL; 1 µg/mL và 1,5 µg/mL. Sau khi chức năng hóa với kháng thể ở nồng độ 0,5 µg/mL đỉnh hấp thụ dịch chuyển về phía bƣớc sóng
bám dính của kháng thể xung quanh các hạt nano vàng khiến kích thƣớc của chúng lớn lên. Tuy nhiên, lớp bám dính này rất mỏng nên sự dịch chuyển đỉnh phổ không nhiều, ngoài ra không thấy sự xuất hiện của các đỉnh khác. Đỉnh hấp thụ UV-vis của nano vàng chức năng hóa với kháng thể ở nồng độ cao hơn vẫn tiếp tục tạo ra sự dịch chuyển về phía bƣớc sóng dài (538 nm) nhƣng có xu hƣớng bão hòa ở nồng độ 1 µg/mL và 1,5 µg/mL [44].
Hình 3.6. Phổ UV-vis của nano vàng (a), và phức hợp nano vàng – kháng thể tương ứng với nồng độ 0,5 µg/mL(b); 1 µg/mL (c) và 1,5 µg/mL (d)
Để đánh giá khả năng thay đổi màu trong điều kiện thực tế, các nồng độ kháng thể trên đã đƣợc thử nghiệm đối với que thử nhanh. Trong thí nghiệm này, trƣớc
màng nitrocellulose theo thƣờng quy chế tạo que thử nhanh. Sau đó nhỏ dung dịch phức hợp vào đầu nhỏ mẫu và quan sát sự hình thành vạch. Hình 3.7 cho thấy khi nhỏ dung dịch không chứa phức hợp nano vàng – kháng thể (0 µg/mL), trên màng nitrocellulose không xuất hiện vạch. Tuy nhiên, vạch ở vị trí đối chứng xuất hiện mờ với phức hợp nano vàng – kháng thể 0,5 µg/mL và trở nên rõ ràng khi nhỏ phức hợp tƣơng ứng với nồng độ kháng thể 1 µg/mL và 1,5 µg/mL.
Hình 3.7. Sự hình thành vạch màu phụ thuộc nồng độ kháng thể gắn với nano vàng
Do vậy, sau khi lặp lại các thí nghiệm cho kết quả tƣơng tự, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn nồng độ kháng thể là 1 µg/mL để tạo ra phức hợp nano vàng-kháng thể để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Xác định độ pH dung dịch nano vàng để tạo phức hợp
Phức hợp kháng thể - hạt nano vàng đƣợc tạo thành theo nguyên lý hấp phụ vật lý một cách thụ động thông qua tƣơng tác tĩnh điện giữa các nhóm mang điện trên kháng thể và bề mặt hạt nano vàng. Một số nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng khả năng hấp phụ tốt nhất ở điều kiện pH bằng hoặc lớn hơn điểm đẳng điện (pI) của kháng thể. Do đó, pH là điều kiện quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu suất cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng [4], [29], [45]. Trong khi đó, kháng thể đã đƣợc chứng minh có giá trị điểm đẳng điện nằm trong khoảng pH 6,0 – 8,5. Để xác định giá trị pH thích hợp để tạo cộng hợp, dung dịch nano vàng đã đƣợc thay đổi các giá trị pH khác nhau. Kết quả đã cho thấy rằng tại pH 6,0 trên vạch đối chứng không xuất hiện tín hiệu. Tuy nhiên, từ pH 7,0 thì tín hiệu đậm dần và rõ ràng nhất ở pH7,5 – pH8,0. Tại giá trị pH 8,5 cũng xuất hiện vạch màu nhƣng mờ và to hơn các vạch màu ở độ pH thấp hơn. Nhƣ vậy, giá trị pH 7,5 đƣợc nhóm nghiên cứu lựa chọn để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
3.2.3.Xác định thời gian tạo phức hợp nano vàng – kháng thể
Một trong những yếu tố quan trọng có khả năng ảnh hƣởng đến khả năng gắn kết của kháng thể lên bề mặt hạt nano vàng và duy trì hoạt tính của chúng sau khi gắn kết, đó là thời gian để hình thành phức hợp. Quá trình tạo phức hợp nano vàng – kháng thể nếu quá nhanh thì không đủ để các phần tử kháng thểm hấp phụ lên trên bề mặt hạt nano vàng. Tuy nhiên, để lâu dƣới ánh sáng và nhiệt độ cao cũng có thể dẫn tới khả năng kết tụ hoặc làm mất hoạt tính của kháng thể. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện để xác định ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình tạo phức hợp giữa kháng thể với nano vàng ở thời gian 10, 30, và 60 phút ở nhiệt độ phòng. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau khi ủ 10 phút phức hợp không tạo ra vạch màu trên que thử nghiệm mà chúng chỉ hình thành đối với phức hợp ủ 30 phút và rõ ràng hơn ở 60 phút. Kết quả này cho thấy rằng thời gian ủ để tạo thành phức hợp nano vàng – kháng thể ít nhất phải 30 phút trở lên. Tuy nhiên, do thời gian và điều kiện thí nghiệm chƣa cho phép nên thí nghiệm chƣa tiến hành đƣợc khi ủ ở thời gian lâu hơn.
3.2.4.Nhiệt độ tạo phức hợp
Thông thƣờng, kháng thể duy trì hoạt tính tốt khi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 2- 80C trƣớc khi sử dụng. Bản chất của kháng thể là protein nên nhiệt độ có ảnh