3.2.4 .Nhiệt độ tạo phức hợp
3.4 Khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng sử dụng phức hợp nano vàng –
– kháng thể tích hợp trên que thử nhanh
Trong nghiên cứu này, sau khi chứng minh thành công khả năng tạo ra phức hợp nano vàng – kháng thể và duy trì tốt hoạt tính sinh học của chúng sau quá trình chế tạo, nhóm đã tiến hành các bƣớc tiếp theo để tạo ra que thử nhanh để phát hiện vi khuẩn tụ cầu (S. aureus) ở một nồng độ xác định. Mẫu đối chứng đƣợc thử nghiệm với vi khuẩn E. coli O157 ở cùng nồng độ và điều kiện thí nghiệm.
Trƣớc tiên, mẫu đƣợc ly tâm để quan sát về mặt hình thái dƣới kính hiển vi điện tử quét. Hình 3.12 là ảnh SEM của vi khuẩn tụ cầu (Hình 3.12a) và E. coli
(Hình 3.12b) của mẫu trƣớc khi kiểm tra bằng que thử mà nhóm nghiên cứu chế tạo đƣợc. Bằng mắt thƣờng dễ dàng có thể thấy rằng vi khuẩn tụ cầu hình cầu, kết tụ lại giống nhƣ một chum nho đặc trƣng cho vi khuẩn Gram dƣơng. Trong khi đó E. coli là vi khuẩn Gram âm có dạng dài thuôn, lớp vỏ mỏng nên dễ bị xẹp khi chiếu chùm tia điện tử của kính hiển vi điện tử quét lên bề mặt.
Hình 3.12. Ảnh SEM của vi khuẩn tụ cầu vàng (a) và vi khuẩn E.coli O157 (b)
quả phát hiện vi khuẩn tụ cầu (cột trái) với 5/5 mẫu khi cả hai vạch màu đều xuất hiện trên que thử. Trong khi đó, khi thử nghiệm với vi khuẩn E. coli O157, trên que chỉ xuất hiện 1 vạch ở vị trí đối chứng. Kết quả này cho thấy rằng phức hợp nano vàng – kháng thể có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hình ảnh vạch màu rõ nét và dễ dàng có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Nhƣ vậy, mô hình này cũng cho thấy hoàn toàn có thể tạo ra những phức hợp nano vàng với các loại kháng thể khác nhau để hƣớng tới những ứng dụng trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh khác bằng phƣơng pháp đo màu.
Hình 3.13. Vạch màu xác nhận khả năng phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) (cột trái) và E. coli O157 (cột phải) sử dụng que thử nhanh tích hợp
3.5 Kết luận
Chƣơng này đã trình bày những kết quả nghiên cứu và thảo luận về việc chế tạo hạt nano vàng sạch bằng phƣơng pháp điện hóa, đồng thời khảo sát các đặc tính quang của chúng trƣớc và sau khi chức năng hóa với kháng thể ứng dụng trong phát hiện tác nhân gây bệnh. Các phép khảo sát về yếu tố ảnh hƣởng đến phức hợp nano vàng – kháng thể cũng đã đƣợc thực hiện nhƣ nồng độ kháng thể, độ pH, thời gian và nhiệt độ để hình thành phức hợp nano vàng - kháng thể. Những kết quả nghiên cứu ban đầu đã cho thấy phức hợp nano vàng – kháng thể có hiệu quả tốt khi thử nghiệm trên que thử để phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng ở nồng độ 103
cfu/ml. Vạch màu do phức hợp tạo ra rõ nét và tập trung, kể cả đối với trƣờng hợp âm tính khi thử với E. coli O157.
KẾT LUẬN CHUNG
Luận văn đã đạt đƣợc những mục tiêu đề ra với những kết quả chính sau:
1. Đã điều chế thành công nano vàng sạch bằng phƣơng điện hóa, các phép phân tích đặc trƣng lý hóa đã cho thấy hạt nano vàng chế tạo đƣợc có độ sạch cao, hạt hình cầu, đồng nhất với kích thƣớc 15-18 nm, thích hợp cho các ứng dụng y sinh.
2. Đã chức năng hóa thành công hạt nano vàng với kháng thể kháng vi khuẩn tụ cầu vàng và khảo sát các đặc tính quang của chúng khi chức năng với một số nồng độ kháng thể nhất định. Kết quả cho thấy, nồng độ kháng thể 1 µg/mL thích hợp với việc chức năng với nano vàng ở trên với nồng độ 200 µg/mL.
3. Đã khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự hình thành phức hợp nano vàng – kháng thể với các giá trị pH dung dịch nano vàng 7.5; thời gian ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng;
4. Đã thử nghiệm chế tạo thành công que thử và đóng gói để phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng. Kết quả cho thấy, que thử có khả năng cho kết quả dƣơng tính với 2 vạch màu rõ nét đối với nồng độ vi khuẩn tụ cầu vàng ở 103cfu/mL, trong khi đó chỉ có 1 vạch màu rõ nét đối với mẫu đối chứng là vi khuẩn E. coli O157
KIẾN NGHỊ
- Thiết kế và chế tạo que thử nhanh để phát hiện vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện trên cơ sở phức hợp nano vàng – kháng thể và kỹ thuật sắc ký miễn dịch (xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện);
- Ứng dụng phức hợp nano vàng – kháng thể làm mô hình để phát triển các bộ kít chẩn đoán hay điều trị mầm bệnh trên cơ sở hiệu ứng quang nhiệt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Elahi N., Kamali M., and Baghersad M.H. (2018). Recent biomedical applications of gold nanoparticles: A review. Talanta, 184, 537–556. 2. Ogarev V.A., Rudoi V.M., and Dement’eva O. V. (2018). Gold
Nanoparticles: Synthesis, Optical Properties, and Application. Inorg Mater Appl Res, 9(1), 134–140.
3. Tiwari P., Vig K., Dennis V., et al. (2011). Functionalized Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications. Nanomaterials, 1(1),
31–63.
4. Huy T.Q., Huyền P.T.M., Thủy N.T., et al. (2016). Sự phát triển của kỹ thuật sắc ký miễn dịch trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Tạp chí Y học dự phòng, 26(15), 9–20.
5. Long H. (2018), Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của nano vàng, định hướng ứng dụng trong y sinh. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
6. Gold Gold. <https://www.lenntech.com/periodic/elements/au.htm>. 7. Gold properties. <https://www.webelements.com/gold/physics.html>. 8. Gold crystal structure.
<https://crystallography365.files.wordpress.com/2014/01/gold.jpg>. 9. Gold colloids. <https://www.sciencedirect.com/topics/pharmacology-
toxicology-and-pharmaceutical-science/colloidal-gold>.
10. Yeh Y.-C., Creran B., and Rotello V.M. (2012). Gold Nanoparticles: Preparation, Properties, and Applications in Bionanotechnology.
science/nanomaterials/gold-nanoparticles.html>.
12. Shukla R., Bansal V., Chaudhary M., et al. (2005). Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: A microscopic overview. Langmuir, 21(23), 10644–10654. 13. Mafuné F., Kohno J.Y., Takeda Y., et al. (2002). Full physical preparation
of size-selected gold nanoparticles in solution: Laser ablation and laser- induced size control. J Phys Chem B, 106(31), 7575–7577.
14. Ma H., Yin B., Wang S., et al. (2004). Synthesis of Silver and Gold Nanoparticles by a Novel Electrochemical Method. ChemPhysChem, 5(1), 68–75.
15. Huang C.J., Chiu P.H., Wang Y.H., et al. (2006). Electrochemically controlling the size of gold nanoparticles. J Electrochem Soc, 153(12),
193–198.
16. Fu W., Shenoy D., Li J., et al. (2005). Biomedical applications of gold nanoparticles functionalized using hetero-bifunctional poly(ethylene glycol) spacer. Mater Res Soc Symp Proc, 845, 223–228.
17. Zhang G., Yang Z., Lu W., et al. (2009). Influence of anchoring ligands and particle size on the colloidal stability and in vivo biodistribution of polyethylene glycol-coated gold nanoparticles in tumor-xenografted mice.
Biomaterials, 30(10), 1928–1936.
18. Lee S.H., Bae K.H., Kim S.H., et al. (2008). Amine-functionalized gold nanoparticles as non-cytotoxic and efficient intracellular siRNA delivery carriers. Int J Pharm, 364(1), 94–101.
19. Rayavarapu R.G., Petersen W., Ungureanu C., et al. (2007). Synthesis and bioconjugation of gold nanoparticles as potential molecular probes for light-based imaging techniques. Int J Biomed Imaging, 2007, 29817
20. Chanda N., Kattumuri V., Shukla R., et al. (2010). Bombesin functionalized gold nanoparticles show in vitro and in vivo cancer receptor specificity. Proc Natl Acad Sci U S A, 107(19), 8760–8765.
21. Sisco P.N., Wilson C.G., Mironova E., et al. (2008). The Effect of Gold Nanorods on Cell-Mediated Collagen Remodeling. Nano Lett, 8(10),
3409–3412.
22. Haidekker M.A., Boettcher L.W., Suter J.D., et al. (2006). Influence of gold nanoparticles on collagen fibril morphology quantified using transmission electron microscopy and image analysis. BMC Med Imaging,
6, 1–7.
23. Pellegrino T., Sperling R.A., Alivisatos A.P., et al. (2007). Gel electrophoresis of gold-DNA nanoconjugates. J Biomed Biotechnol, 2007, 26796.
24. Chen C., Wang W., Ge J., et al. (2009). Kinetics and thermodynamics of DNA hybridization on gold nanoparticles. Nucleic Acids Res, 37(11),
3756–3765.
25. Javier D.J., Nitin N., Levy M., et al. (2008). Aptamer-targeted gold nanoparticles as molecular-specific contrast agents for reflectance imaging. Bioconjug Chem, 19(6), 1309–1312.
26. Dykman L.A. and Khlebtsov N.G. (2011). Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae, 3(2), 34–55. 27. Cordeiro M., Carlos F.F., Pedrosa P., et al. (2016). Gold nanoparticles for
diagnostics: Advances towards points of care. Diagnostics, 6(4), 43
28. Verma M.S., Rogowski J.L., Jones L., et al. (2015). Colorimetric biosensing of pathogens using gold nanoparticles. Biotechnol Adv, 33(6),
29. Thị Thanh Huyền Đ. (2018), Nghiên cứu tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.
30. Nehl C.L. and Hafner J.H. (2008). Shape-dependent plasmon resonances of gold nanoparticles. J Mater Chem, 18(21), 2415–2419.
31. Meneghetti V. and Moreno A. (2009). Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. J Phys Chem C, 113(11), 4277–
4285.
32. Chen P.Z. and Gu F.X. (2019), Gold Nanoparticles for Colorimetric Detection of Pathogens, Encyclopedia of Biomedical Engineering (Elsevier Inc).
33. Wu Y., Ali M.R.K., Chen K., et al. (2019). Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today, 24, 120–140.
34. Huy T.Q., Hien Thanh N.T., Thuy N.T., et al. (2017). Cytotoxicity and antiviral activity of electrochemical – synthesized silver nanoparticles against poliovirus. J Virol Methods, 241, 52–57.
35. Thuc D.T., Huy T.Q., Hoang L.H., et al. (2017). Antibacterial Activity of Electrochemically Synthesized Colloidal Silver Nanoparticles Against Hospital-Acquired Infections. J Electron Mater, 46(6).
36. Thuc D.T., Huy T.Q., Hoang L.H., et al. (2016). Green synthesis of colloidal silver nanoparticles through electrochemical method and their antibacterial activity. Mater Lett, 181, 173–177.
37. Yao H. and Kimura K. (2007). Field Emission Scanning Electron Microscopy for Structural Characterization of 3D Gold Nanoparticle Superlattices. Mod Res Educ Top Microsc, 568–575.
physicochemical characterization of nanomaterials. Biotechnol Adv, 32(4), 711–726.
39. Murawska M., Wiatr M., Nowakowski P., et al. (2013). The structure and morphology of gold nanoparticles produced in cationic gemini surfactant systems. Radiat Phys Chem, 93, 160–167.
40. Park J., Joo J., Soon G.K., et al. (2007). Synthesis of monodisperse spherical nanocrystals. Angew Chemie - Int Ed, 46(25), 4630–4660.
41. Kumar A., De A., Saxena A., et al. (2014). Environmentally benign synthesis of positively charged, ultra-low sized colloidal gold in universal solvent. Adv Nat Sci Nanosci Nanotechnol, 5(2), 025017
42. Compostella F., Pitirollo O., Silvestri A., et al. (2017). Glyco-gold nanoparticles: Synthesis and applications. Beilstein J Org Chem, 13,
1008–1021.
43. Zhao W., Brook M.A., and Li Y. (2008). Design of gold nanoparticle- based colorimetric biosensing assays. ChemBioChem, 9(15), 2363–2371. 44. Peng H. and Chen I.A. (2019). Rapid Colorimetric Detection of Bacterial
Species through the Capture of Gold Nanoparticles by Chimeric Phages.
ACS Nano, 13(2), 1244–1252.
45. Masereel B., Dinguizli M., Bouzin C., et al. (2011). Antibody immobilization on gold nanoparticles coated layer-by-layer with polyelectrolytes. J Nanoparticle Res, 13(4), 1573–1580.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
Vũ Quang Khuê, Hoàng Long, Vũ Thị Lanh, Nguyễn Thị Luyến, Phạm Thế
Tân, Trần Quang Huy. Ảnh hƣởng của điện áp đến sự hình thành hạt và đặc tính quang của nano vàng điều chế bằng phƣơng pháp điện hóa. Tạp chí Khoa học công nghệ - ĐH Thái Nguyên, 2018; 190(14): 25-30. ISSN: 1859 - 2171