3. Nội dung nghiên cứu
3.3.2. Định danh các chủng vi khuẩn nitrate hóa
3.3.2.1. Hình thái tế bào vi sinh vật
Xác định hình thái tế bào vi khuẩn thấy 3 chủng có hình cầu, 9 chủng có hình que và que ngắn, Xác định Gram của vi khuẩn thấy 11 chủng Gram âm và 1 chủng Gram dương (bảng 3.10).
Bảng 3.10. Đặc điểm hình dạng tế bào vi khuẩn, Gram và hình ảnh tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được tại Hải Phòng, Quảng Ninh Tên mẫu Kí hiệu
khuẩn lạc
Hình dạng
tế bào Hình thái tế bào Gram
Hải Hà 01
H2W Que ngắn +
Tên mẫu Kí hiệu khuẩn lạc
Hình dạng
tế bào Hình thái tế bào Gram
H5S Que - Đồ Sơn 01 D3W Cầu - D4S Que - D6S Que - D7S Que -
Tên mẫu Kí hiệu khuẩn lạc
Hình dạng
tế bào Hình thái tế bào Gram
Tiên Yên 01 T2W Que ngắn - T3W Que - T5W Que - T6S Que - T8S Cầu -
3.3.2.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA
Sau khi tách chiết DNA tổng số,các mẫu vi khuẩn sẽ được xác định tên chủng bằng gen 16S rRNA. Quá trình nhân bản đoạn gen 16S rRNA được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.7. Chương 2. Kết quả phản ứng PCR được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả PCR các mẫu DNA vi khuẩn nitrate hóa
M: Marker 100bp
1-12: H2W, H4S, H5S, D3W, D4S, D6S, D7S, T2W, T3W, T5W, T6S, T8S
Trên điện di đồ (hình 3.10) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu đều có kích thước khoảng 1,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và đủ điều kiện thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Sau khi giải trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA thu được của các chủng vi khuẩn nitrate hoá này với trình tự gen 16S rRNA trên ngân hàng gen bằng công cụ BLAST. Kết quả thu được như bảng 3.11 và phụ lục 1.
STT Chủng vi khuẩn
tỷ lệ tương đồng (%)
Trình tự
tương đồng Tên chủng tương đồng
1 H2W 99,64 NR_117649 Nitrosomonas europaea 2 H4S 99,58 NR_074324 Nitrobacter winogradskyi 3 H5S 98,63 NR_104815 Nitrosomonas marina 4 D3W 99,64 NR_117649 Nitrosomonas europaea 5 D4S 97,85 NR_104819 Nitrosococcus nitrosa 6 D6S 99,51 NR_074324 Nitrobacter winogradskyi 7 D7S 97,68 NR_104817 Nitrosomonas halophila 8 T2W 97,26 NR_027578 Nitrobacter hamburgensis 9 T3W 98,20 NR_117649 Nitrosomonas europaea 10 T5W 96,71 NR_104818 Nitrosomonas aesturii 11 T6S 98,84 NR_104819 Nitrosomonas nitrosa 12 T8S 99,72 NR_074324 Nitrobacter winogradskyi
Kết quả cho thấy, 12 chủng vi khuẩn thu được đều thuộc 2 giống
Nitrosomonas và Nitrobacter. Tỷ lệ tương đồng đều đạt hơn 96,71% so với các trình tự gốc trên ngân hàng gen thế giới.
3.3.2.3 Kết quả định danh các loài vi khuẩn nitrate hóa
Các loài vi khuẩn nitrate hóa được phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh hóa kết hợp với phương pháp sinh học phân tử theo khóa phân loại Bergey 1973. Phân lập được 12 loài vi khuẩn nitrate hóa thuộc 2 giống vi khuẩn. Hai loài vi khuẩn đặc trưng nhất là Nitrosomonas europaea và Nitrobacter winogradskyi đều có trong các mẫu phân tích. Ngoài ra, còn có các loài vi khuẩn khác như: Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas aesturii.... (bảng 3.12).
Bảng 3.12. Bảng tên định danh của các loài vi khuẩn nitrate hóa phân lập được tại Hải Phòng và Quảng Ninh
Tên mẫu Kí hiệu khuẩn lạc Tên định danh
Hải Hà 01 H2W Nitrosomonas europaea H4S Nitrobacter winogradskyi H5S Nitrosomonas marina Đồ Sơn 01 D3W Nitrosomonas europaea D4S Nitrosomonas nitrosa D6S Nitrobacter winogradskyi D7S Nitrosomonas halophila Tiên Yên 01 T2W Nitrobacter hamburgensis T3W Nitrosomonas europaea T5W Nitrosomonas aesturii T6S Nitrosomonas nitrosa T8S Nitrobacter winogradskyi
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã thu thập được các mẫu vật nghiên và xác định được các yếu tố thuỷ lí, thuỷ hoá như nhiệt độ, pH, nồng độ muối, lượng oxy hoà tan, độ trong, NH4+, NO2ˉ, NO3ˉ, BOD5 COD... Đối chiếu theo tiêu chuẩn Việt Nam QCVN: 10:2008/ BTNMT thì hầu hết các chỉ tiêu đều đạt trong khoảng giới hạn cho phép đối với nước nuôi trồng thủy sản. Một số chỉ tiêu vượt giới hạn như nồng độ TAN, COD....
2. Đã xác định được mật độ vi sinh vật tổng số và mật độ vi khuẩn nitrate hóa tại các khu vực nghiên cứu. Mật độ vi khuẩn nitrate hóa ghi nhận được tại các khu vực nghiên cứu dao động trong khoảng 4,00 đến 7,60.102 MPN/ml.
3. Phân lập được 20 loài vi khuẩn từ 3 mẫu trong đó có 12 loài có hoạt tính, còn lại 08 chủng không có hoạt tính, 12 loài vi khuẩn đều thuộc 2 nhóm
Nitrosomonas và Nitrobacter. Hai loài vi khuẩn đặc trưng nhất là Nitrosomonas europaea và Nitrobacter winogradskyi đều có trong các mẫu phân tích.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu thêm về quá trình xử lý môi trường nước bằng nhóm vi khuẩn nitrate hóa bản địa để làm chế phẩm sinh học đưa vào ứng dụng thực tế trong nuôi trồng thủy sản hiện nay.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đặng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,
Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Tỵ (1976). Các
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, NXB Khoa học và kỹ thuật,
Tr 21 – 30.
2. Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007), "Phân lập và tuyển
chọn các chủng vi khuẩn nitrate hóa đề xử lý nước hồ bị ô nhiễm", Tạp chí
Khoa học Công nghệ ,45(10): 95-100.
3. Cao Ngọc Điệp và Đoàn Tấn Lực (2014), "Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi
khuẩn chuyển hoá nitơ và photpho từ bãi rác để xử lý N và P trong nước rỉ
rác", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 33: 117-124.
4. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật, NXB Giáo dục, Tr 27 – 34, 103
-102.
5. Hoàng Phương Hà, Nguyễn Quang Huy, Hoàng Thị Yến (2016), "Nghiên cứu
một số điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tạo Biofilm của các chủng vi
khuẩn khử nitrate", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 14(1): 191-196.
6. Lại Thị Thúy Hiền, Nguyễn Bá Tú, Đỗ Thu Phương, Phạm Thị Hằng, Nguyễn
Thị Yến, Vương Thị Nga, Võ Mai Hương, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thu Thủy, Bùi Lê Thanh Nhàn (2008), "Nghiêu cứu sản xuất chế phẩm sinh học
Nitrobact ứng dụng trong xử lý nước nuôi tôm tại Thừa Thiên - Huế", Tạp
chí Công nghệ Sinh học, 6 (2):249-256.
7. Nguyễn Thị Thanh, Trần Liên Hà (2006), "Phân lập chủng vi khuẩn phản nitrate
hóa với mục tiêu ứng dụng trong xử lý nước hồ nhiễm", Tuyển tập báo cáo
Hội nghị Khoa học lần thứ 20, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, 243 –
246.
8. Trần Cẩm Vân (2005), Giáo trình Vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học
TIẾNG ANH
9. Achuthan C., Rejíh Kumar V. J., Manju N. J., Philip R., Singh I. S. B. (2006).
Development of nitrifying bacterial consortia for immobilizing in nitrifying bioreactors designed for penaeid and non-penaeid larval rearing systems in
the tropics. Indian J of marine science, 35(3): 240-248.
10. Baskaran V., Patil P. K., Antony M. L., Avunje S., Nagaraju V. T., Ghate S. D.,
Nathamuni S., Dineshkumar N., Alavandi S. V., Vijayan K. K. (2020). Microbial community profiling of ammonia and nitrite oxidizing bacterial enrichments from brackishwater ecosystems for mitigating nitrogen
species. Scientific Reports, (10): 5201
11. Brenner D. J, Krieg N. R, Staley J. T, Garrity G. M (2005). Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology-Part C.2 ed, Springer.
12. Capone D. G, Bronk D. A, Mulholland M. R, Carpenter E. J. (2008). Nitrogen
in the marine environment. 2 ed.; Elsevier Inc.
13. Daims H. , Lücker S., Wagner M. (2016). A new perspective on microbes formerly
known as nitrite-oxidizing bacteria. Trends Microbiol. 24: 699–712.
14. Ehrich S., Behrens D., Lebedeva E., Ludwig W., Bock E. (1995). A new
obligately chemolithoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira
moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch Microbiol
146:16-23.
15. Fan H., Bolhuis H., Stal L. J. (2015). Nitrification and Nitrifying Bacteria in a
Coastal Microbial Mat. Front. Microbiol. 6: 1367. doi:
10.3389/fmicb.2015.01367.
16. Fujitani H., Kumagai A., Ushiki N., Momiuchi K., Tsuneda S. (2015) Selective
isolation of ammonia-oxidizing bacteria from autotrophic nitrifying granules
by applying cell-sorting and sub-culturing of microcolonies. Front.
Microbiol. 6: 1159. doi: 10.3389/fmicb.2015.01159.
17. Lau E., Frame C. H., Nolan E. J., Stewart F. J., Dillard Z.W., Lukich D. P.,
and relative abundance of ammonia- and nitriteoxidizing microorganisms in the offshore Namibian hypoxic zone. PLoS ONE 14(5): e0217136. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217136
18. Maeda J. W. (1985). Allowable ammonia for fish culure. Prg. Fish-Cult.
47:135-145.
19. Meiklejohn J. (1949). The Isolation of Nitrosomonas europaea in pure culture.
Soil Microbiology Department, Rothamsted Experimental Station, Harpenden, Hertfordshire. 185-191
20. Rodríguez A. R., Inchaustegui S. M., Castro L. P., Montealegre R. J., Vargas J.
P. H. (2017) Isolation of ammonium- and nitrite-oxidizing bacterial strains from soil, and their potential use in the reduction of nitrogen in household
waste water. Int. J. Trop. Biol., 65 (4): 1527-1539.
21. Shan H., Obbard J. P., (2001). Ammonia removal from prawn aquaculture water
using immobilized nitrifying bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57 (5-
6):791-798
22. Smil V. (2000). Cycles of Life. ScientificAmerican Library, New York.
23. Soulwène K., Saidi N., hiri F.M', Nasr H., Cherif H., Ouzari H., Hassen A.
(2011). Isolation and characterization of facultative mixotrophic ammonia-
oxidizing bacteria from constructed wetlands. Journal of Environmental
Sciences. 23 (10):1699-1708
24. Spieck E., Lipski A. (2011) Methods in Enzymeology, Chapter five -
Cultivation, Growth Physiology, and Chemotaxonomy of Nitrite-Oxidizing Bacteria. ScienceDirect, 486: 109-130. https://doi.org/10.1016/B978-0-12- 381294-0.00005-5.
25. Subasinghe, R.P., Curry, D., McGladdery, S.E. & Bartley, D. (2003). Recent
Technological Innovations in Aquaculture. Review of the state of world
aquaculture. FAO Fisheries Circular No. 886.
26. Tal Y., Schreier H. J., Sowers K. R., Stubblefield J. D., Place A. R., Zohar
Y. (2009). Environmentally sustainable land-based marine aquaculture.
27. Stein L. Y. (2015) Microbiology: Cyanate fuels the nitrogen cycle. Nature 524(7563). DOI: 10.1038/nature14639.
28. Taylor S. M., He Y. L., Zhao B., Huang J. (2009). Heterotrophic ammonium
removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying
bacterium, Providencia rettgeri YL. Journal of Environmental Sciences, 21
(10):1336-1341
29. Watson S. W., Bock E., Harms H., Koops H. P., Hooper A. B. (1989) Nitrifying
bacteria in Bergey’s manual of systematic bacteriology, Vol.3. Stanley J.T. (editor). Williams & Wilkins in Baltimore, Hong Kong, London and Sydney. p.1808-1834
30. Van Riji J., Yossi Tal, Harold J. Schreier (2006). Denitrification in recirculating
system: Theory and application. Aquacultural Eng. 34: 364-376.
TÀI LIỆU INTERNET
31. Alleman, J. E., Preston, K. (2005). Behavior and Physiology of Nitrifying
Bacteria, 15/08/2020. http://web.deu.edu.tr/atiksu/ana58/nitri.doc.
32. Mỹ Hạnh (2020) Chế phẩm sinh học xử lý nước bị nhiễm ammoni, 15/08/2020.
http://www.noip.gov.vn/vi_VN/web/guest/sang-che-viet/-
/asset_publisher/XzSH8lY4WRq7/content/che-pham-sinh-hoc-xu-ly-nuoc- bi-nhiem-ammoni
33. Quá trình Nitrat hóa và ứng dụng vi khuẩn Nitrat hóa trong ao tôm, 15/08/2020.
https://drtom.vn/qua-trinh-nitrat-hoa.html.
34. Xử Lý Nước Thải Nuôi Trồng Thủy Sản Bằng Hệ Thống RAS, 15/08/2020.
http://www.congnghemoitruong.info/2016/04/xu-ly-nuoc-thai-nuoi-trong- thuy-san.html.
PHỤ LỤC 1
KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ TƯƠNG ĐỒNG BẰNG CÔNG CỤ BLAST Chủng vi khuẩn H2W
Chủng vi khuẩn H4S
Chủng vi khuẩn D3W
Chủng vi khuẩn D4S
Chủng vi khuẩn D7S
Chủng vi khuẩn T2W
Chủng vi khuẩn T5W
Chủng vi khuẩn T6S
PHỤ LỤC 2
MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG THU MẪU, PHÂN TÍCH MẪU
Hình 2. Nhân giống cấp 1 mẫu thu được
Hình 3. Nhân giống cấp 2 mẫu có hoạt tính cao