3. Nội dung nghiên cứu
1.4.2. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nitrate hóa cũng được quan tâm nghiên cứu. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nitrate được công bố [2], [3], [5], [7].
Năm 2008, tác giả Lại Thúy Hiền và cs đã phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa của nhóm vi khuẩn nitrate hóa phân lập trong môi trường
ven biển Thanh Hóa và Thừa Thiên Huế. Nhóm nghiên cứu đã phát triển ra 2 dòng chế phẩm Nitrobacter-1 và Nitrobacter-2, và áp dụng vào các ao nuôi tôm tại thị trấn Sịa, huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế cho hiệu quả kinh tế xử lí cao hơn so với một số sản phẩm thương mại có sẵn trên thị trường [6].
Nhóm tác giả Trần Liên Hà và cs đã thu 9 mẫu đất và nước xung quanh khu vực Hà Nội để phân lập và nghiên cứu. Kết quả cho thấy trong 2 mẫu đất trên bề mặt hồ và 3 mẫu đất lấy độ sâu 0, 5m không một vi khuẩn nitrate hóa nào được tìm thấy, 4 mẫu lấy trên bề mặt hồ ghi nhận vi khuẩn nitrate hóa. Khi nghiên cứu điều kiện môi trường cho sự sinh trưởng của các chủng phân lập được cho thấy pH và nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn sự sinh trưởng của vi khuẩn. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn sinh trưởng là 30oC, ưu pH trung tính hoặc kiềm nhẹ [2].
Năm 2014, Cao Ngọc Điệp và Đoàn Tấn Lực đã phân lập 45 dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ và 52 dòng vi khuẩn tích luỹ polyphosphate được phân lập từ nước rỉ rác của 5 bãi rác ở Vĩnh Long, Cần Thơ và Hậu Giang. Khảo sát trên môi trường bổ sung NH4+, NO2-, NO3- và hỗn hợp 3 loại Nitơ (bao gồm NH4+, NO2-, NO3-) với lượng orthophosphate. Kết quả thu được 3 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và 3 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P cao, các dòng này được chọn để giải trình tự và sử dụng phần mềm BLAST N để so sánh với các trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu gen của NCBI. Kết quả cho thấy 3 dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ thuộc chủng Enterobacter và Klebsiella, trong khi dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P thuộc chủng Exiguobacterium và Acinetobacter. Hỗn hợp hai dòng
Enterobacter sp. (TNĐ1.4) và Acinetobacter soli (HP3.2) làm giảm lượng ammonium, Nitrite, Nitrate, orthophosphate trong nước rỉ rác ở mức thấp nhất sau 5 ngày đồng thời hàm lượng khí ammoniac thải ra thấp nhất [3].
Năm 2016, Hoàng Phương Hà và cs Việc chọn được các điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo màng biofilm của vi khuẩn khử nitrate. Kết quả cho thấy hai chủng vi khuẩn D10 và D32 có khả năng khử nitrate và tạo biofilm
cao nhất, chúng thích nghi ở pH 6,5-7; nhiệt độ 37oC; nồng độ các chất hữu cơ Methalnol và Ethanol (M1, E2) là 0,006 % thì hiệu suất khử N- NO3- đạt 80% và 100% tương ứng. Khi có oxy quá trình khử nitrate vẫn xảy ra ở chủng D32 nhưng chỉ đạt hiệu suất 25,8%. Kết quả xác định vị trí phân loại của 2 chủng vi khuẩn lựa chọn dựa vào phân tích trình tự gen 16S rRNA của chúng cho thấy, chủng D10 gần với loài Bacillus fusiformis, D32 gần với Pseudomonas denitrifricans
[5].
Nhóm nghiên cứu của Đỗ Mạnh Hào và cs cũng quan tâm và tiến hành nghiên cứu các nhóm vi khuẩn nitrate hóa từ khá sớm. Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu trầm tích và nước tại các khu nuôi trồng thủy sản ven biển Hải Phòng. Nhóm đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn oxy ammonia có hoạt tính cao. Một số chủng đã được lựa chọn vào nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa và mối quan hệ với nhiệt độ, pH, oxy hòa tan, chất mang. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn chịu mặn kí hiệu Pl13001 có hoạt tính oxy hóa ammonia cao ở nhiệt độ 25 - 30oC, pH từ 6 - 8, oxy hòa tan lớn hơn 2mg/l. Hoạt lực oxy hóa ammonia của Pl13001 khi ở trạng thái bám dính bám trên vật liệu là hạt nhựa nổi, hạt zeolite cao hơn hẳn so với trạng thái tự do. Tốc độ loại bỏ ammonia trong hệ thống nuôi liên tục với vật liệu dính bám là hạt nhựa nổi dao động trong khoảng 18, 72 - 25, 34g/m3/ ngày, trung bình là 20, 95g/m3/ ngày.
Tác giả Hoàng Phương Hà và các cộng sự ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm sinh học dùng đề xử lý nước bị nhiễm ammoni, dựa trên nguyên lý hoạt động của nhóm vi khuẩn nitrate hóa. Chế phẩm sinh học chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn nitrate hóa, bao gồm chủng vi khuẩn oxy hóa ammoni
Nitrosomonas eutropha PĐ 58, Nitrosomonaseuropaea PĐ 60 và chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite Nitrobacter winogradskyi 2NM, Nitrobacter vulgaris 5NM. Nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm chế phẩm sinh học để xử lý 1000 lít nước bị ô nhiễm ammoni, với hàm lượng 5 - 50g chế phẩm nitrate hóa rắc đều trên 1000
lít nước. Kết quả cho thấy, chỉ sau 48 giờ cả hai thành phần ammoni và nitrite trong mẫu nước bị ô nhiễm ammoni đã được chuyển hóa gần như hoàn toàn, hàm lượng ammoni chỉ còn 0,05 mgN/L, đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với cơ sở nuôi trồng thủy sản thương phẩm. Chế phẩm có hiệu quả cao trong việc làm sạch môi trường nước bị ô nhiễm ammoni, giúp tái sử dụng nước nuôi trồng thủy sản mà không cần thay nước, lại an toàn, đơn giản, dễ thực hiện và phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam. Chế phẩm này và quy trình sản xuất nó đã được Cục Sở hữu trí tuệ (Bộ KH&CN) cấp bằng độc quyền giải pháp hữu ích số 2- 0002027 được công bố vào ngày 27/5/2019 [32].
Chương 2
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất, địa điểm, thời gian nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu nước thu tại vùng biển đảo Hải Phòng-
Quảng Ninh.
Thiết bị: Nồi hấp khử trùng Hariyama HV50- 220 (Nhật Bản), Box cấy ESCO
class II (Indonesia), tủ sấy (Đức), bình tam giác 250ml (Đức), pipet Eppendorf (Đức), siêu điện (Trung Quốc), cân điện tử AND GH 200 (Nhật Bản), …
Hóa chất: Đường sucrose, agar, thủy ngân, cồn, nước cất, (NH4)2SO4,
NaNO2, K2HPO,... có nguồn gốc từ Mỹ, Đức, Trung Quốc, Việt Nam…
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học,
Trường ĐHSP Thái Nguyên và Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn, Viện Tài nguyên và Môi trường biển.
Thời gian nghiên cứu: tháng 03/2019 đến tháng 05/2020
Địa điểm thu mẫu: Tiên Yên, Vân Đồn, Đầm Hà, Hải Hà thuộc tỉnh
Quảng Ninh (hình 2.1); Cát Bà, Đồ Sơn thuộc thành phố Hải Phòng. Các địa điểm lấy mẫu được trình bày bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng tọa độ thu mẫu
STT Tên mẫu Kí hiệu Ngày thu mẫu Tọa độ
1 Đầm Hà 01 DH 01 23/5/2019 21°27'59.25"N, 107°47'34.09"E
2 Đầm Hà 02 DH 02 23/5/2019 21°27'31.40"N; 107°47'13.18"E
3 Hải Hà 01 HH 01 23/5/2019 21°21'2.09"N; 107°38'59.09"E
4 Hải Hà 02 HH 02 23/5/2019 21°19'43.78"N; 107°37'52.78"E
5 Tiên Yên 01 TY 01 24/5/2019 21°16'8.90"N; 107°25'52.60"E
6 Tiên Yên 02 TY 02 24/5/2019 21°13'5.76"N; 107°25'41.90"E
7 Vân Đồn 01 VD 01 24/5/2019 21° 8'2.05"N; 107°35'44.5"E 8 Vân Đồn 02 VD 02 24/5/2019 21° 10'10.80"N; 107°34'29.8"E 9 Đồ Sơn 01 DS 01 25/5/2019 20°42'14.85"N; 106°44'52.22"E 10 Đồ Sơn 02 DS 02 25/5/2019 20°45'02.96"N; 106°46'37.3"E 11 Cát Bà 01 CB 01 26/5/2019 20°47'52.3"N 106°55'56.1"E 12 Cát Bà 02 CB 02 26/5/2019 20°44'12.3"N 107°03'37.2"E
Hình 2.1. Sơ đồ địa điểm thu mẫu tại tỉnh Quảng Ninh
Hình 2.2. Sơ đồ địa điểm thu mẫu tại thành phố Hải Phòng Các môi trường nuôi cấy
Quần hợp vi khuẩn nitrate hóa trong chế phẩm gồm 3 nhóm vi sinh vật: Vi khuẩn dị dưỡng, vi khuẩn tự dưỡng hóa năng và vi khuẩn tự dưỡng hóa năng chuyên biệt (không phát triển trên môi trường có agar).
Công thức 1: Môi trường khoáng tự dưỡng winogradsky.
Bảng 2.2. Công thức pha môi trường tự dưỡng Winogradsky – agar
Thành phần 1 lít 300ml
Nước biển 1000ml 300ml
(NH4)2SO4/NaNO2 4,72/4,93 mg 1,416/1,479 mg
K2HPO4 0,88mg 0,264mg
pH 8 8
Công thức 2: Môi trường dị dưỡng MPA
Bảng 2.3. Công thức pha môi trường dị dưỡng PCA
Thành phần 1 lít 300ml
Peptone 5g 1,5g (Nên cho cuối)
Cao nấm men 2,5g 0,75g (Nên cho cuối)
Glucozo 1g 0,3g
Agar 20g 5,4g (cho cuối cùng sau khi
chuẩn pH)
H2O 1000ml 300ml
NaCl 15g (cửa sông) 4,5g
- Nếu pha MT PCA 15 ‰ thì NaCl = 15g/1l MT. - Nếu pha MT PCA 30 ‰ thì NaCl = 30g/1l MT. - pH = 7,2 – 7,5 (Giấy chuẩn pH): Giấy quỳ. - pH thấp cho NaOH 2N.
- pH cao cho HCl 2N.
- Chuẩn pH xong cho Agar (để 15 – 30’) rồi khuấy.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Phương pháp thu mẫu theo TCVN 5998 - 1995 (ISO 5667-9: 1992) và TCVN 6663-1: 2011 (ISO 5667-1: 2006).
Phương pháp bảo quản mẫu theo TCVN 6663-3: 2008 (ISO 5667-3: 2003)
2.2.2. Phương pháp phân tích thông số thủy lí
Các thông số thuỷ lí được phân tích theo một số tiêu chuẩn và phương pháp như bảng 2.4.
Bảng 2.4. Phương pháp phân tích thông số thủy lí STT Thông số Đơn vị Số hiệu tiêu chuẩn và phương pháp
1 Nhiệt độ to TCVN 4557: 1988
Nhiệt kế thủy ngân hoặc máy đo nhiệt độ, chính xác 0,1o C
2 Độ mặn
(Sal.) ‰ Khúc xạ kế cầm tay (Hand Refrecometer) với độ chính
xác lên đến 1‰
3 pH TCVN 6492: 2010 (ISO 10523: 1983)
Máy đo pH (Nhật) chính xác 0, 01 đơn vị
4 Độ trong cm Đo bằng đĩa Secchi
5 DO mg/l TCVN 7324: 2004 (ISO 5813: 1983)
Máy đo DO (MARTINI- Rumani) chính xác ± 1,5%
2.3.3. Phương pháp phân tích thông số thủy hóa
Các thông số thuỷ hoá được phân tích theo một số tiêu chuẩn và phương pháp như bảng 2.5.
Bảng 2.5. Phương pháp phân tích các thông số thủy hóa STT Thông số Đơn vị Số hiệu tiêu chuẩn và phương pháp
1 COD mg/l TCVN 6491: 1999 (ISO 6060: 1989)
Phương pháp oxy hóa KMnO4 trong môi trường kiềm
2 BOD5 mg/l TCVN 6001-1: 2008 (ISO 5815-1: 2003)
Phương pháp không pha loãng và không cấy vi sinh
3 NH4+ mg/l TCVN 5988: 1995 (ISO 5664: 1984)
Xác định ammoni bằng phương pháp xanh phenat
4 NO2ˉ mg/l TCVN 6178:1996 (ISO 6777: 1984)
Xác định nitrite bằng phương pháp màu diazo
5 NO3ˉ mg/l TCVN 6643: 2000 (ISO 14255: 1998)
2.3.4. Phương pháp phân tích, xác định mật độ vi khuẩn tổng số và vi khuẩn nitrate hóa nitrate hóa
a. Phương pháp phân tích vi sinh vật
Nhóm vi sinh vật tổng số: nhóm vi sinh vật hiếu khí tổng số được phân tích bằng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường PCA thạch. Sau 24 - 48h nuôi, tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường [4].
Nhóm vi khuẩn nitrate hóa: số lượng vi sinh vật có khả năng oxy hóa ammonia hay oxy hóa nitrite được nuôi cấy theo phương pháp pha loãng tới hạn trên môi trường khoáng Winogradsky có bổ sung cơ chất ammonia và nitrite đối với từng loại vi khuẩn. Sau 7˗15 ngày nuôi cấy trong máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 28˗30oC tiến hành kiểm tra kết quả nuôi cấy.
b. Cách xác định mật độ vi khuẩn có trong mẫu
* Cách xác định số lượng vi sinh vật ở các mẫu nuôi cấy trong môi trường thạch.
- Ở mỗi độ pha loãng đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường. Mỗi khuẩn lạc tương ứng với một tế bào vi sinh vật ban đầu.
- Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính từ số liệu của độ pha loãng K theo công thức:
A= X/(K.V)
Trong đó: A: là số khuẩn lạc vi sinh vật mọc trên một đơn vị thể tích ml. Đơn vị tính là CFU/ml.
X: là số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trường khi nuôi cấy ở một hệ số pha loãng.
V: thể tích mẫu (ml) pha loãng đã dùng để cấy. K: hệ số pha loãng của dịch được nuôi cấy.
* Cách xác định số lượng vi sinh vật ở các mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng:
- Được tính theo phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất). Đây là phương pháp định lượng số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện
diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Việc định lượng này được thực hiện lặp đi lặp lại 3 lần ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.
- Cấy khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc, nuôi trong điều kiện 37oC trong 24h.
- Cấy tiếp khuẩn từ các ống nghiệm lần 1 sang môi trường tăng sinh chọn lọc tiếp theo, nuôi trong điều kiện 37oC trong 24h.
- Sau một thời gian nuôi cấy nhất định xác định sự hiện diện của vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy. Nếu ống nào có vi sinh vật xuất hiện cho kết quả dương tính. Sau khi đọc kết quả của các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy, dùng bảng Mac Crady để tính số lượng vi sinh vật có trong mẫu.
2.3.5. Phương pháp phân lập, làm giàu và thuần khiết các chủng vi khuẩn
nitrate hóa
a. Phương pháp phân lập và làm giàu các quần xã vi khuẩn nitrate hóa
Mẫu vật sẽ được làm giầu trong 100 ml dịch môi trường, các bình nuôi cấy được nuôi trong điều kiện thường trên máy lắc. Thành phần môi trường nuôi cấy gồm: nước biển 1000 ml; (NH4)2SO4 4,72 mg hoặc NaNO2 4,93 mg; K2HPO4 0,88 mg; pH = 8 [4], [7].
Tất cả các bình nuôi cấy đều được thu mẫu hàng ngày để phân tích nồng độ cơ chất NH4+ và điều chỉnh pH. Khi nồng độ cơ chất trong lần thu mẫu kế tiếp giảm không đáng kể so với lần thu mẫu trước đó sẽ tiến hành cấy truyền dịch vào môi trường mới với tỷ lệ 1:9 (v/v).
Việc cấy truyền sẽ kết thúc khi thời gian cho quá trình sử dụng cơ chất trong lần nuôi tiếp theo không giảm đáng kể so với lần nuôi trước đó.
b. Phân lập và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate hóa
Trong thành phần của mẫu vật thu thập được khi tăng sinh gồm 2 nhóm vi sinh vật: vi khuẩn tự dưỡng hóa năng và vi khuẩn tự dưỡng hóa năng chuyên biệt (không phát triển trên môi trường có agar).
Các nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường Winogradsky- Agar: nước biển 1000ml; (NH4)2SO4 4,72 mg hoặc NaNO2 4,93 mg; K2HPO4 0,88 mg; pH=8 [9].
Thuần khiết các nhóm vi sinh vật bằng thạch đĩa Winogradsky có bổ sung cơ chất.
Mẫu được nuôi cấy trên đĩa thạch đĩa hoặc bản silicagell có bổ sung môi trường Winogradsky trong 2-3 tuần. Sau khi phân lập được các chủng vi khuẩn nitrate hóa thuần khiết sẽ tiến hành phân tích các đặc điểm hình thái bằng nhuộm tế bào, sinh hóa [4], [7] và giải trình tự gen 16S rRNA.
c. Phương pháp xác định hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa
Cấy các nhóm vi sinh vật phân lập được vào 20ml môi trường nuôi cấy chứa cơ chất (4,72 mg/l (NH4)2SO4 hoặc 4,93 mg/l NaNO2), nuôi tại nhiệt độ phòng trên máy lắc.
Sau 15 ngày nuôi cấy lấy mẫu kiểm tra nồng độ cơ chất để xác định hoạt tính của vi sinh vật.
2.3.6. Phương pháp xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Phân tích hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm màu Fuchsin, nhuộm Gram, tế bào sau khi được cố định trên tiêu bản sẽ được quan sát dưới kính hiển vi phản pha [4].
2.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn nitrate hóa bằng gen 16S rRNA
Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập sẽ được tách chiết DNA bằng kit G-pin của Hãng iNtRON.
Sau đó, đoạn gen 16S rRNA sẽ được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1492R theo thành phần và chu trình nhiệt như bảng 2.6 và bảng 2.7.
Trình tự mồi: 27F: 5′-AGAGTTTGATCATGGCT-3′ 1492R: 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nước khử ion 6,0 µl
2 GoTaq Green Master Mix 2X 7,5 µl
5 27F (10pmol/µl) 0,5 µl
6 1492R (10pmol/µl) 0,5 µl
7 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 0,5 µl
Tổng thể tích 15 µl
Sau khi vi khuẩn được cố đinh, ta tiến hành nhuộm tiêu bản. Nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch giữ màu 1 phút.
Tẩy màu bằng cồn 95% có chứa iốt. Thời gian ngâm rửa trong 30 giây.
Rửa nước, thấm nhẹ xung quanh vết bôi và bổ sung bằng safranin 30 giây đến 1 phút