3. Nội dung nghiên cứu
2.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn nitrate hóa bằng gen 16S rRNA
Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập sẽ được tách chiết DNA bằng kit G-pin của Hãng iNtRON.
Sau đó, đoạn gen 16S rRNA sẽ được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1492R theo thành phần và chu trình nhiệt như bảng 2.6 và bảng 2.7.
Trình tự mồi: 27F: 5′-AGAGTTTGATCATGGCT-3′ 1492R: 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nước khử ion 6,0 µl
2 GoTaq Green Master Mix 2X 7,5 µl
5 27F (10pmol/µl) 0,5 µl
6 1492R (10pmol/µl) 0,5 µl
7 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 0,5 µl
Tổng thể tích 15 µl
Sau khi vi khuẩn được cố đinh, ta tiến hành nhuộm tiêu bản. Nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch giữ màu 1 phút.
Tẩy màu bằng cồn 95% có chứa iốt. Thời gian ngâm rửa trong 30 giây.
Rửa nước, thấm nhẹ xung quanh vết bôi và bổ sung bằng safranin 30 giây đến 1 phút
Rửa nước, thấm và hong khô. Sau đó quan sát với vật kính dầu. Kết quả, vi khuẩn G+ cho màu xanh tím, vi khuẩn G- cho màu hồng.
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 40 giây
35
3 Gắn mồi 55 60 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 60 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng
10 ∞
Sau đó sản phẩm PCR được thu lại và tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn đoạn gen 16S rRNA được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem).