3. Nội dung nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp phân lập, làm giàu và thuần khiết các chủng vi khuẩn
nitrate hóa
a. Phương pháp phân lập và làm giàu các quần xã vi khuẩn nitrate hóa
Mẫu vật sẽ được làm giầu trong 100 ml dịch môi trường, các bình nuôi cấy được nuôi trong điều kiện thường trên máy lắc. Thành phần môi trường nuôi cấy gồm: nước biển 1000 ml; (NH4)2SO4 4,72 mg hoặc NaNO2 4,93 mg; K2HPO4 0,88 mg; pH = 8 [4], [7].
Tất cả các bình nuôi cấy đều được thu mẫu hàng ngày để phân tích nồng độ cơ chất NH4+ và điều chỉnh pH. Khi nồng độ cơ chất trong lần thu mẫu kế tiếp giảm không đáng kể so với lần thu mẫu trước đó sẽ tiến hành cấy truyền dịch vào môi trường mới với tỷ lệ 1:9 (v/v).
Việc cấy truyền sẽ kết thúc khi thời gian cho quá trình sử dụng cơ chất trong lần nuôi tiếp theo không giảm đáng kể so với lần nuôi trước đó.
b. Phân lập và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate hóa
Trong thành phần của mẫu vật thu thập được khi tăng sinh gồm 2 nhóm vi sinh vật: vi khuẩn tự dưỡng hóa năng và vi khuẩn tự dưỡng hóa năng chuyên biệt (không phát triển trên môi trường có agar).
Các nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường Winogradsky- Agar: nước biển 1000ml; (NH4)2SO4 4,72 mg hoặc NaNO2 4,93 mg; K2HPO4 0,88 mg; pH=8 [9].
Thuần khiết các nhóm vi sinh vật bằng thạch đĩa Winogradsky có bổ sung cơ chất.
Mẫu được nuôi cấy trên đĩa thạch đĩa hoặc bản silicagell có bổ sung môi trường Winogradsky trong 2-3 tuần. Sau khi phân lập được các chủng vi khuẩn nitrate hóa thuần khiết sẽ tiến hành phân tích các đặc điểm hình thái bằng nhuộm tế bào, sinh hóa [4], [7] và giải trình tự gen 16S rRNA.
c. Phương pháp xác định hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa
Cấy các nhóm vi sinh vật phân lập được vào 20ml môi trường nuôi cấy chứa cơ chất (4,72 mg/l (NH4)2SO4 hoặc 4,93 mg/l NaNO2), nuôi tại nhiệt độ phòng trên máy lắc.
Sau 15 ngày nuôi cấy lấy mẫu kiểm tra nồng độ cơ chất để xác định hoạt tính của vi sinh vật.