3. Nội dung nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp phân tích, xác định mật độ vi khuẩn tổng số và vi khuẩn
nitrate hóa
a. Phương pháp phân tích vi sinh vật
Nhóm vi sinh vật tổng số: nhóm vi sinh vật hiếu khí tổng số được phân tích bằng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường PCA thạch. Sau 24 - 48h nuôi, tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường [4].
Nhóm vi khuẩn nitrate hóa: số lượng vi sinh vật có khả năng oxy hóa ammonia hay oxy hóa nitrite được nuôi cấy theo phương pháp pha loãng tới hạn trên môi trường khoáng Winogradsky có bổ sung cơ chất ammonia và nitrite đối với từng loại vi khuẩn. Sau 7˗15 ngày nuôi cấy trong máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 28˗30oC tiến hành kiểm tra kết quả nuôi cấy.
b. Cách xác định mật độ vi khuẩn có trong mẫu
* Cách xác định số lượng vi sinh vật ở các mẫu nuôi cấy trong môi trường thạch.
- Ở mỗi độ pha loãng đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường. Mỗi khuẩn lạc tương ứng với một tế bào vi sinh vật ban đầu.
- Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính từ số liệu của độ pha loãng K theo công thức:
A= X/(K.V)
Trong đó: A: là số khuẩn lạc vi sinh vật mọc trên một đơn vị thể tích ml. Đơn vị tính là CFU/ml.
X: là số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trường khi nuôi cấy ở một hệ số pha loãng.
V: thể tích mẫu (ml) pha loãng đã dùng để cấy. K: hệ số pha loãng của dịch được nuôi cấy.
* Cách xác định số lượng vi sinh vật ở các mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng:
- Được tính theo phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất). Đây là phương pháp định lượng số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện
diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Việc định lượng này được thực hiện lặp đi lặp lại 3 lần ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.
- Cấy khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc, nuôi trong điều kiện 37oC trong 24h.
- Cấy tiếp khuẩn từ các ống nghiệm lần 1 sang môi trường tăng sinh chọn lọc tiếp theo, nuôi trong điều kiện 37oC trong 24h.
- Sau một thời gian nuôi cấy nhất định xác định sự hiện diện của vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy. Nếu ống nào có vi sinh vật xuất hiện cho kết quả dương tính. Sau khi đọc kết quả của các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy, dùng bảng Mac Crady để tính số lượng vi sinh vật có trong mẫu.