Nuôi cấy bùn hoạt tính hiếu khí:
Sử dụng phương thức sục khí để nuôi dưỡng bùn hoạt tính hiếu khí. Lấy bùn hoạt tính tại Nhà máy Cốc hóa - Công ty Cổ phần Gang thép Thái Nguyên có bổ sung các chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrat hóa, nitrit hóa
đã phân lập được, thêm 1 lít nước thải đã qua xử lí nội điện phân và bổ sung nguồn dĩnh dưỡng với tỷ lệ C:N:P = 100:5:1, có bổ sung 1,0 g các chủng vi khuẩn nitrat, nitrit hóa và phản nitrat hóa từ chế phẩm vi sinh xử lý nước thải có hàm lượng amoni cao. Hàm lượng oxy hòa tan cung cấp cho bể hiếu khí 1,5 - 3,0 mg/L. Tiến hành thổi khí 12h, sau đó để lắng 2h, loại bỏ phần nước trong, tiếp tục bổ sung nước thải và nguồn dinh dưỡng mới. Bổ sung thể tích nước thải phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật (ban đầu là 20% sau đó 50%, 70% thể tích bể). Quá trình này được lặp lại nhiều lần trong một thời gian 1 tuần, tuần tiếp theo thời gian sục khí giảm xuống còn 6h. Quá trình nuôi cấy bùn hoạt tính được tiến hành ở nhiệt độ phòng, giá trị pH là 6,5 -7,0 và kéo dài hai tuần.
Nuôi cấy bùn hoạt tính thiếu khí:
Lấy bùn hoạt tính tại Nhà máy Cốc hóa - Công ty Cổ phần Gang thép Thái Nguyên, thêm 1 lít nước thải đã qua xử lí nội điện phân và bổ sung dinh dưỡng đảm bảo tỉ lệ C:N:P = 150:5:1, có bổ sung 1,0 g các chủng vi khuẩn nitrat, nitrit hóa và phản nitrat hóa từ chế phẩm vi sinh xử lý nước thải có hàm lượng amoni cao. Hàm lượng oxy hòa tan cung cấp cho bể thiếu khí 1,0 - 2,0 mg/L. Thời gian nuôi cấy 24h sau đó để lắng 2h, loại bỏ nước trong, tiếp tục bổ sung nước thải và nguồn dinh dưỡng mới. Bổ sung thể tích nước thải phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật (ban đầu là 20% sau đó 50%, 70% thể tích bể). Quá trình nuôi cấy bùn hoạt tính được tiến hành ở nhiệt độ phòng, giá trị pH là 6,5 -7,5 và kéo dài trong vòng 15 - 20 ngày.
Nuôi cấy bùn hoạt tính kị khí:
Lấy bùn hoạt tính tại Nhà máy Cốc hóa - Công ty Cổ phần Gang thép Thái Nguyên, thêm 1 lít nước thải đã qua xử lí nội điện phân và bổ sung dinh dưỡng đảm bảo tỉ lệ C:N:P = 200:5:1, có bổ sung 1,0 g các chủng vi khuẩn nitrat, nitrit hóa và phản nitrat hóa từ chế phẩm vi sinh xử lý nước thải có hàm lượng amoni cao, giá trị pH 7,6 - 8,5. Thời gian nuôi cấy 24h sau đó
tiến hành lắng 2h, loại bỏ nước trong, tiếp tục bổ sung nước thải và nguồn dinh dưỡng mới. Bổ sung thể tích nước thải phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật (ban đầu là 20% sau đó 50%, 70% thể tích bể). Do vi khuẩn methan có tốc độ sinh trưởng chậm, tuổi thọ dài nên quá trình nuôi cấy bùn hoạt tính được tiến hành ở nhiệt độ phòng, giá trị pH là 6,5 -7,5 và kéo dài trong khoảng 1 tháng.
Để kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật trong các bể phản ứng chúng tôi kiểm tra nồng độ vi khuẩn thông qua việc phân lập vi khuẩn.
a. Bể kị khí b. Bể thiếu khí c. Bể hiếu khí
Hình 2.1: Nuôi cấy bùn hoạt tính tại phòng thí nghiệm 2.7.2. Xác định thông số SV30, MLSS
Trong vận hành, thông số thể tích bùn lắng sau 30 phút gọi tắt là SV30 (mL/L)
Phương pháp đo: lấy một hỗn hợp bùn vi sinh đang hoạt động, rót vào cốc 1000mL, để lắng 30 phút. Lượng bùn sau lắng là SV30.
Thông số SV30 đánh giá được nồng độ bùn hoạt tính: khả năng tạo bông của bùn, khả năng lắng của bùn, khả năng xử lý nước (đánh giá theo cảm quan).
Nồng độ bùn hoạt tính MLSS
Việc phân tích MLSS nhằm xác định nồng độ bùn hoạt tính trong bể hiếu khí và tính được chỉ số thể tích lắng của bùn.
Phương pháp xác định:
+ Bước 1: Cân giấy lọc đã sấy ở 105oC, xác định khối lượng A (g) + Bước 2: Lấy 50 mL V mẫu vào cốc nung
+ Bước 3: Lọc mẫu qua giấy đã sấy + Bước 4: Sấy ở nhiệt độ 105oC trong 1h
+ Bước 5: Cân giấy có sinh khối đã sấy, xác định khối lượng B (g) Công thức tính MLSS:
MLSS = (B - A).1000
V (mg/L) Trong đó:
+ MLSS: hàm lượng bùn hoạt tính (mg/L) + B: trọng lượng mẫu giấy có sinh khối, g; + A: trọng lượng giấy không có sinh khối, g; + V: Thể tích mẫu, mL
2.7.3. Thiết lập hệ A2O-MBBR xử lý nước thải và nước thải đã tiền xử lí vật liệu nội điện phân Fe-C, Fe-Cu liệu nội điện phân Fe-C, Fe-Cu
Thiết kế hệ A2O-MBBR có thể tích mỗi bể là 3 lít và có nhiều đường cấp và thoát nước khác nhau để tiện cho quá trình nghiên cứu lựa chọn thời gian lưu (HRT). Sử dụng bùn hoạt tính từ nhà máy, có bổ sung các chủng vi khuẩn nitrat,
nitrit hóa và phản nitrat hóa từ chế phẩm vi sinh xử lý nước thải có hàm lượng amoni cao.
Hình 2.2: Sơ đồ hệ thống A2O-MBBR
Nuôi cấy bùn hoạt tính: Tại bể hiếu khí, sục khí duy trì hàm lượng DO trong khoảng 5 - 8 mg/L, bể thiếu khí duy trì DO trong khoảng giá trị 1 - 2 mg/L bằng máy khuấy có tốc độ khuấy 150 vòng phút, chiều dài cánh khuấy là 3 cm.
Tại các bể kị khí, thiếu khí và hiếu khí bổ sung giá thể MBBR dạng biochip. Tỷ lệ giá thể bổ sung vào các bể là 1 gam:1 lít nước thải. Mỗi bể chứa 3 lít bổ sung lượng giá thể là 3 gam. Giá thể di động MBBR (Moving Bed Biofilm Reactor) là loại giá thể sử dụng trong hệ thống xử lý nước thải, kết hợp quá trình xử lý sinh học thiếu khí hoặc hiếu khí truyền thống và giá thể di động dính bám nhằm tối ưu hóa hiệu suất xử lý các thành phần ô nhiễm, đặc biệt xử lý tốt nitơ và photpho có trong nước thải.
Tiến hành vận hành phản ứng và xử lí nước thải ban đầu trong 30 - 45 ngày với các thông số vận hành hệ thống xử lý như sau:
Bảng 2.1: Thông số ban đầu vận hành hệ A2O-MBBR
Bể phản ứng COD (mg/L ) MLSS (mg/L ) pH DO (mg/L) Thời gian lưu (h) Kị khí 2359 1800 - 2000 7,5 - 8 - 24 Thiếu khí 2000 - 2300 1 - 2 6 Hiếu khí 4000 - 4500 5 - 8 4
Sau khi nghiên cứu xử lí nước thải ban đầu trong vòng 30 - 45 ngày, tiến hành xử lí nước thải đã tiền xử lí nội điện phân (điều chỉnh lại pH = 8) với thời gian lưu: kị khí 24 giờ, thiếu khí 6 giờ, hiếu khí 4 giờ.
2.8. Thực nghiệm phân lập vi sinh vật trên môi trường LB
- Pha môi trường thạch LB:
Cân đủ lượng các hóa chất: cao nấm men (Yeast extract grannulated): 5,0 g; Peptone: 10,0 g; NaCl: 5,0 g; thạch Agar: 20,0 g. Pha các hóa chất trên vào nước cất và định mức tới 1000 mL. Môi trường thạch sau khi pha được hấp, làm lỏng trong lò vi sóng và đổ vào đĩa petri.
- Pha loãng mẫu:
Cân 1,0 g bùn hoạt tính cho vào ống nghiệm chứa 9,0 mL nước muối sinh lý vô trùng, trộn đều bằng máy vôltex.
Hút tiếp 1,0 mL dịch ở ống nghiệm trên cho vào ống nghiệm thứ hai cũng đựng 9,0 mL dịch nước muối sinh lý.
Mỗi lần hút truyền sang ống nghiệm là ta đã pha loãng mười lần, để chính xác thay đầu pipét sau mỗi lần pha loãng. Pha loãng đến nồng độ 106.
- Cấy truyền vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa petri:
Dùng pipet man nhỏ 0,1 mL dung dịch chứa vi khuẩn đã pha loãng lên mặt thạch trong đĩa petri.
Dùng que trang đã khử trùng trải đều giọt dịch chứa khuẩn lên bề mặt thạch Đậy nắp hộp lồng, dán nhãn cho hộp lồng gồm ngày thực hiện, nồng độ pha loãng tên môi trường.
Quá trình cấy truyền vi khuẩn lên môi trường thạch thực hiện trong box cấy vi sinh, thiết bị que trang, pipep man vô khuẩn.
Gói hộp lồng và đưa vào tủ ấm.
Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức:
CFU/mL(g) = a.1/K.1/V Trong đó:
CFU - Conoly forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc. Một CFU được coi là một khuẩn lạc phát triển từ một tế bào đầu trên môi trường dinh dưỡng thạch mà mắt thường nhìn thấy.
a: Số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch.
V: Thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên mặt thạch. K: Độ pha loãng của dịch được nuôi cấy.
2.9. Quy trình quan sát tế bào hình thái vi sinh vật
Làm tiêu bản vi khuẩn
+ Bước 1: Xử lý nhiệt lam kính: Đốt hai mặt lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trước khi làm tiêu bản. Loại bỏ dầu, vết bẩn trên hai mặt lam kính.
+ Bước 2: Dàn tiêu bản: Từ khuẩn lạc vi khuẩn: Dùng que cấy vô trùng lấy một phần khuẩn lạc vi khuẩn hòa đều vào 1 giọt nước muối sinh lý vô trùng trên lam kính thứ nhất. Đốt khử trùng que cấy, để nguội rồi nhúng đầu que cấy vào giọt vi khuẩn sau đó dàn đều vi khuẩn sang lam kính thứ hai theo hình xoắn ốc từ trong ra ngoài.
+ Bước 3: Để khô tiêu bản: Tiêu bản được để khô tự nhiên hoặc hơ cao khoảng 20 cm trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Bước 4: Cố định tiêu bản: Lật úp tiêu bản để mặt dàn vi khuẩn quay xuống dưới, đưa tiêu bản cắt ngang qua 2/3 trên của ngọn lửa đèn cồn từ 3 đến 4 lần.
Kỹ thuật nhuộm
+ Bước 1: Nhỏ dung dịch tím gentian phủ kín vết bôi, để 1 phút, rửa nhẹ tiêu bản bằng bình nón có vòi.
+ Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol phủ kín vết bôi, để 30 giây, rửa nhẹ tiêu bản bằng bình nón có vòi.
+ Bước 3: Nhỏ vài giọt cồn 90° lên vết bôi, nghiêng tiêu bản để cồn láng từ cạnh nọ sang cạnh kia tiêu bản, láng cồn tới khi nào quan sát thấy màu tím trên tiêu bản vừa phai hết thì lập tức rửa nhẹ tiêu bản bằng bình nón có vòi.
+ Bước 4: Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin phủ kín vết bôi, để 1 phút, rửa nhẹ tiêu bản bằng bình nón có vòi.
Đọc kết quả tiêu bản nhuộm trên kính hiển vi quang học vật kính dầu
- Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím. - Vi khuẩn Gram (-): bắt màu đỏ.
2.10. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên môi trường phân lập LB để giữ giống vi sinh vật phân lập LB để giữ giống vi sinh vật
- Pha môi trường LB: Cân đủ lượng các hóa chất: cao nấm men (Yeast extract grannulated): 5,0 g; Peptone: 10,0 g; NaCl: 5,0 g; thạch Agar: 20,0 g. Pha các hóa chất trên vào nước cất và định mức tới 1000 mL. Môi trường thạch sau khi pha được hấp, làm lỏng trong lò vi sóng, đổ ra đĩa petri.
- Nghiền, pha loãng vi sinh vật đã phân lập được với nước cất vô trùng. - Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa petri bằng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
+ Để đĩa petri chứa môi trường thạch LB lên bàn.
+ Dùng que cấy lấy vi sinh vật đã được pha loãng với nước cất vô trùng. + Tay trái hé mở nắp đĩa petri vừa đủ để cho que cấy vào.
+ Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch môi trường LB theo theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
Quá trình cấy truyền vi khuẩn lên môi trường thạch thực hiện trong box cấy vi sinh, thiết bị que cấy vô khuẩn.
Nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC và theo dõi trong vòng từ 24 - 48h. Quá trình này được lặp đi lặp lại liên tục để giữ giống vi sinh vật.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lập đường chuẩn xác định nồng độ phenol tại pH = 3, pH = 4
Đo diện tích peak của các dung dịch trên ở bước sóng nm theo thứ tự: dung dịch có nồng độ từ thấp đến cao trên máy HPLC. Kết quả được ghi ở bảng 3.1 và hình 3.1 với pH = 4, bảng 3.2 và hình 3.2 với pH = 3.
Bảng 3.1: Kết quả đo diện tích peak của dung dịch phenol ở các nồng độ khác nhau tại pH = 4
C (mg/L) 0 25 50 100 150 200 250 Diện tích
peak (Area) 0 312909 450334 987750 1494475 1888250 2304519
Hình 3.1: Đường chuẩn xác định nồng độ phenol tại pH = 4
Bảng 3.2: Kết quả đo diện tích peak của dung dịch phenol ở các nồng độ khác nhau tại pH = 3 C(mg/L) 0 50 75 100 150 175 200 Diện tích peak (Area) 0 450334 730534 987750 1454475 1642843 1817013 272 y = 9241.8x + 39401 R² = 0.997 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 0 50 100 150 200 250 300 Ar ea C (mg/L)
Hình 3.2: Đường chuẩn xác định nồng độ phenol tại pH = 3
Với đường chuẩn xác định nồng độ phenol ta có thể phân tích được nồng độ phenol có trong nước thải Cốc hóa trước và sau khi xử lí bằng vật liệu Fe-C (pH = 4) và vật liệu Fe-Cu (pH=3) cũng như nồng độ phenol trước và sau khi xử lí qua hệ A2O-MBBR.
3.2. Kết quả xử lý nước thải Nhà máy Cốc hóa bằng vật liệu nội điện phân Fe-C, Fe-Cu Fe-C, Fe-Cu
3.2.1. Kết quả xử lý nước thải Nhà máy Cốc hóa bằng vật liệu nội điện phân Fe-C phân Fe-C
Kết quả phân tích phenol trong dung dịch nước thải cốc hóa nồng độ ban đầu là 172,0 mg/L bằng phương pháp HPLC khi không có và có 2,5 g vật liệu nội điện phân Fe-C sau thời gian lắc 12 giờ, pH = 4, tốc độ lắc 200 vòng/phút được thể hiện trên hình 3.3 và 3.4. Kết quả phân tích HPLC cho thấy phenol đã bị phân hủy 73,3% khi sử dụng khối lượng vật liệu là 2,5 g, thời gian lắc 12 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở pH = 4. y = 9266.4x + 19021 R² = 0.9968 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 0 50 100 150 200 250 Ar ea C (mg/L)
Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu nước thải chứa phenol ban đầu với pH = 4
Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu nước thải chứa phenol sau khi xử lý bằng vật liệu nội điện phân Fe-C với pH = 4
3.2.2. Kết quả xử lý nước thải Nhà máy Cốc hóa bằng vật liệu nội điện phân Fe-Cu
Kết quả phân tích phenol trong dung dịch nước thải cốc hóa nồng độ ban đầu là 173,7 mg/L bằng phương pháp HPLC khi không có và có 1,0 g vật liệu nội điện phân Fe-Cu sau thời gian lắc 12 giờ, pH = 3, tốc độ lắc 200 vòng/phút được thể hiện trên hình 3.5 và 3.6. Kết quả phân tích HPLC cho thấy phenol đã
bị phân hủy 70,7% khi sử dụng khối lượng vật liệu là 1,0 g, thời gian lắc 12 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở pH = 3.
Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu nước thải chứa phenol ban đầu với pH = 3
bằng vật liệu nội điện phân Fe-Cu với pH = 3
Kết quả đo TSS, BOD5, COD, tổng N, tổng P, NH4+-N tại Trung tâm Quan trắc Tài Nguyên và Môi trường tỉnh Thái Nguyên thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3: Đặc tính nước thải Cốc hóa trước và sau khi xử lý bằng vật liệu Fe-C và Fe-Cu
STT Thông số
Vật liệu Fe-C Vật liệu Fe-Cu Kết quả (mg/L) H% xử lí Kết quả (mg/L) H% xử lí C0 pH = 4 C sau xử lí C0 pH = 3 C sau xử lí 1 TSS 156,2 76,5 51,0 124,0 63,4 48,9 2 BOD5 1150,0 498,0 56,7 1215,0 540,6 55,5 3 COD 2231,0 1032,0 53,7 2379,0 1189,0 50,0 4 Tổng N 865,0 562,4 35,0 876,0 644,0 26,5 5 Tổng P 16,1 8,5 47,2 15,6 9,3 40,4 6 NH4+-N 391,0 156,0 60,1 473,0 165,2 65,1 7 Phenol 172,0 45,9 73,3 173,7 50,9 70,7 Nhận xét:
Đã thử nghiệm tiền xử lý phenol trong nước thải luyện cốc bằng vật liệu