UV-vis (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích dựa trên hiệu ứng hấp thụ khi vật chất trong dung dịch tương tác với bức xạ điện từ (Hình 2.2). Trong đó, bức xạ điện từ trong phép phân tích có bước sóng từ vùng cực tím đến vùng ánh sáng khả kiến (thông thường: 180 nm – 1100 nm). Do nano vàng có các thuộc tính quang học bề mặt phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên có thể dựa trên các đỉnh hấp thụ UV-vis để xác định sự hình
Thanh vàng Natri citrate trong nước cất 2 lần Máy khuấy từ 2 cm 5 cm 7 cm Con quay
Hình 2.2. Máy quang phổ UV-vis
Chuẩn bị mẫu: Đầu tiên, rửa sạch cuvet thạch anh trong suốt bằng nước cất
2 lần và lau khô bằng giấy sạch. Tiếp theo, bơm dung dịch nano vàng vào cuvet. Sau đó, đặt cuvet chứa dung dịch nano vàng và cuvet chứa nước cất để làm chuẩn vào máy đo phổ UV-vis để quét phổ. Dữ liệu phổ hấp thụ được thu thập trên máy tính và xử lí bằng phần mềm Origin 8.0. Phép đo được thực hiện ở nhiệt độ phòng, trên máy đo phổ hấp thụ tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.3.2. Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có nguyên lý hoạt động tương tự như kính hiển vi quang học. Tuy nhiên, kính hiển vi điện tử truyền qua sử dụng chùm tia điện tử thay cho ánh sáng trắng để tạo hình ảnh. Thấu kính sử dụng là thấu kính điện từ (Hình 2.3). Chùm tia điện tử bắt nguồn từ nguồn phát xạ (Vonfram, LaB6 hay phát xạ trường) qua tụ kính tới vị trí lưới đồng (mẫu) và phóng đại ảnh của mẫu thông qua vật kính, thấu kính phóng, ảnh cuối cùng được quan sát trên màn huỳnh quang (hoặc được camera thu lại và truyền tới màn hình máy tính). Môi
Ảnh TEM là hình ảnh đen trắng phía sau của mẫu, đặc trưng bởi mật độ điện tử truyền qua ngay dưới bề mặt mẫu. Hình ảnh này được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và cuối cùng thu được trên màn huỳnh quang hoặc camera. Kính TEM có độ phân giải khoảng 1-3A0 và độ phóng đại từ x50 tới x1.500.000. Trong nghiên cứu này, TEM qua được sử dụng để khảo sát về hình thái và kích thước của hạt nano vàng.
Hình 2.3. Kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1010, JEOL).
Chuẩn bị mẫu: Nhỏ dung dịch nano vàng lên lưới đồng (loại 200 mắt lưới)
đã phủ màng collodion-cacbon, để khô tự nhiên trước khi đưa vào quan sát trên máy TEM. Thực hiện phép đo trên kính JEM 1010 (JEOL)tại Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) sử dụng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu và giúp quan sát hình thái bề mặt của chúng thông qua các chùm tia điện tử thứ cấp hay tán xạ ngược (Hình 2.4). Từ súng điện tử, chùm điện tử đi qua tụ kính, vật kính, rồi sau đó hội tụ và quét trên bề mặt của mẫu. Hình ảnh SEM là hình ảnh tái tạo bởi máy tính được phản ảnh lại nhờ các điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ ngược, thu được nhờ các đầu dò gắn bên sườn kính.
(Hình 2.4. Kính hiển vi điện tử quét (S-4800, Hitachi).
Chuẩn bị mẫu: Dung dịch nano vàng được li tâm để cô đặc và nhỏ lên bề
mặt đế gắn băng dính cacbon hoặc nhôm, để khô tự nhiên trong không khí, sau đó hút chân không rồi đưa vào kính hiển vi điện tử quét để quan sát hình thái bề mặt và phân bố kích thước hạt nano vàng. Phép đo được thực hiện trên kính SEM phát xạ trường (S4800 – Hitachi) tại Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.3.4. Phương pháp phân tích thành phần (EDX).
Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX), hoặc phổ tán sắc năng lượng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn thông qua việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (chùm điện tử năng lượng cao của kính hiển vi điện tử) (Hình 2.5).
EDX được thực hiện chủ yếu trong các kính hiển vi điện tử. Khi chùm điện tử có năng lượng lớn được chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tương tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử. Việc ghi nhận
phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin về các thành phần nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu.
Phép phân tích EDX trong nghiên cứu này nhằm xác định độ sạch của hạt nano vàng sau khi chế tạo bằng phương pháp điện hóa.
Hình 2.5. Thiết bị phân tích EDX (EMAX-Horiba) gắn trên kính hiển vi
điện tử quét (S-4800, Hitachi).
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được chuẩn bị như phương pháp chuẩn bị để đo SEM
(không phủ kim loại). Cách quan sát mẫu tương tự như với cách quan sát hình ảnh mẫu SEM. Các thông số thiết lập của kính trước khi phân tích EDX bao gồm: điện thế gia tốc là 15kV, khoảng cách làm việc là 15 mm. Phép đo được thực hiện trên thiết bị phân tích phổ tán xạ năng lượng tia X (E-Max, Horiba) gắn trên kính hiển vi điện tử quét (S4800 – Hitachi) tại Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Nhiễu xạ tia X là hiện tượng các chùm tia X nhiễu xạ trên các mặt tinh thể của chất rắn (Hình 2.6). Phương pháp nhiễu xạ tia X được sử dụng để phân tích cấu trúc chất rắn, vật liệu... Về bản chất vật lý, nhiễu xạ tia X cũng gần giống với nhiễu xạ điện tử, sự khác nhau trong tính chất phổ nhiễu xạ là do sự khác nhau về tương tác giữa tia X với nguyên tử và sự tương tác giữa điện tử và nguyên tử. Mỗi nhiễu xạ tương ứng với một tập các mặt phẳng có khoảng cách đều nhau bên trong tinh thể. Từ vị trí và độ chùm của các nhiễu xạ khác nhau quan sát được khi tinh thể từ từ xoay quanh chùm tia X ta xác định được mật độ các electron bên trong tinh thể. Vị trí của các nguyên tử bên trong tinh thể được xác định thông qua việc kết hợp giữa thông tin về mật độ các electron và dữ liệu về thành phần hóa học trong tinh thể.
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc tinh thể của nano vàng sau khi tạo thành bằng phương pháp điện hóa.
Hình 2.6. Máy nhiễu xạ tia X.
(Nguồn: Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)
Chuẩn bị mẫu: Sử dụng mẫu bột nano. Dung dịch nano vàng được cô đặc
sau khi đưa vào quay li tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút, trong 15 phút. Tiếp theo, đặt phần nano vàng lắng đọng lên lam kính tạo thành lớp dày. Sau đó, để khô trong không khí và phân tích nhiễu xạ tia X. Phép đo được thực hiện ở nhiệt độ phòng trên máy đo nhiễu xạ tia X (D8, ADVANCE - Bruker) tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3.6. Phương pháp đo thế Zeta. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Là phép phân tích kích thước hạt dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động học (DLS - dynamic light scattering). Để phép đo cho kết quả chính xác yêu cầu nồng độ hạt cao và tối (từ 0,001% đến 40%) (Hình 2.7). Trong nghiên cứu này, thế Zeta được sử dụng để xác định sự ổn định của dung dịch nano vàng sau khi chế
Hình 2.7.Thiết bị đo thế Zeta.
Chuẩn bị mẫu: bơm dung dịch nano vàng vào cuvet thạch anh trong suốt
rồi đặt cuvet vào máy đo thế Zeta. Dữ liệu từ máy đo được chuyển qua máy tính để xử lý. Phép đo được thực hiện trên máy đo thế Zeta (Malvern-UK) thuộc Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.4. Chức năng hóa nano vàng với kháng thể.
Dung dịch nano vàng được ly tâm, lọc rửa trong nước cất hai lần và loại bỏ hoàn toàn lượng natri citrate tồn dư (nếu có) trong dung dịch. Sau đó, ủ với kháng thể đa dòng thỏ kháng vi khuẩn E.coli O157 trong 1 giờ trước khi ly tâm 14.000 vòng/phút ở 40C tốc độ cao để đảm bảo kháng thể gắn kết vật lý chặt chẽ với hạt nano vàng thông qua các lực liên kết vật lý (Hình 2.8). Dung dịch này sau đó lọc rửa trong đệm PBS pH7.2 và lưu giữ ở 40C trước khi sử dụng.
Hình 2.8. Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng.
2.5. Đánh dấu và phát hiện vi khuẩn E.coli O157 bằng nano vàng.
Nano vàng sau khi chức năng hóa với kháng thể sẽ được thử nghiệm để đánh giá khả năng đánh dấu và phát hiện vi khuẩn E.coli O157 thông qua kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử theo thường quy của phòng thí nghiệm (Hình 2.9) [37], [38]. Quy trình này có thể tóm tắt như sau: mẫu vi khuẩn E.coli O157 ở nồng độ 106
cfu/mL được cố định trong dung dịch glutaraldehyde 0,5% trong thời gian 20 phút, tiếp theo đưa lưới đồng đã phủ màng collodion-cacbon lên trên một giọt mẫu để vi khuẩn có thể bị hút bám lên trên màng. Sau đó, lưới được rửa 3 lần trên giọt dung dịch đệm PBS pH7.4, tiếp tục ủ lưới có mẫu với cộng hợp nano vàng – kháng thể trong 30 phút. Rửa lại 3 lần trên giọt dung dịch đệm PBS và để khô trong không khí trước khi quan sát bằng TEM.
2.6. Kết luận.
Chương 2 đã mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, các phương pháp phân tích, quy trình và nguyên lý đã được sử dụng để thực hiện đề tài nghiên cứu. Các thiết bị và phép phân tích hiện đại của các phòng thí nghiệm hàng đầu của Việt Nam, các thiết bị phân tích hiện đại có độ tin cậy và chính xác cao.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Chế tạo hạt nano vàng bằng phương pháp điện hóa.
3.1.1. Sự hình thành nano vàng quan sát bằng mắt thường.
Với phương pháp điện hóa, nano vàng đã được chế tạo thành công từ vàng khối trong nước cất 2 lần chỉ thông qua 1 bước, với sự hỗ trợ của một lượng natri citrate nhỏ cỡ 0,1%. Trong nghiên cứu này, quá trình hình thành hạt nano vàng được khảo sát theo sự thay đổi màu sắc quan sát bằng mắt thường, điện áp sử dụng, lượng natri citrate đưa vào và thời gian chế tạo.
Để khảo sát sự ảnh hưởng của điện áp đưa vào, sau các quá trình thử nghiệm ban đầu, chúng tôi lựa chọn và cố định nồng độ natri citrate 0,1% và thời gian chế tạo trong 2 giờ. Kết quả quan sát bằng mắt thường cho thấy, không có sự thay đổi màu sắc trong dung dịch chế tạo với điện áp 3V, kiểm tra phổ hấp thụ UV-vis cũng không thấy xuất hiện đỉnh hấp thụ [kết quả không đưa ra]. Tuy nhiên, ở các mức điện áp lớn hơn, dung dịch có hiện tượng đổi màu theo thời gian. Do vậy, sự hình thành hạt nano vàng được khảo sát khi thay đổi điện áp dòng một chiều trên hai điện cực trong khoảng 6V- 15V, với bước thay đổi 3V.
Kết quả quan sát cho thấy, sau 30 phút đến 2 giờ, màu sắc của dung dịch trong bình điện hóa đã thay đổi từ trắng trong lần lượt sang hồng nhạt và hồng đậm, trong đó chế tạo ở điện áp 15V cho dung dịch mầu đậm nhất, màu sắc của dung dịch chế tạo ở 9V và 12V không có sự khác biệt đáng kể, trong khi mẫu chế tạo ở điện áp 6V có màu nhạt hơn (Hình 3.1).
Sự thay đổi màu sắc dung dịch bằng mắt thường trước và sau khi chế tạo có thể xác nhận sơ bộ sự hình thành hạt nano trong dung dịch. Điều này có thể giải thích bằng hiện tượng plasmon bề mặt của hạt nano vàng sau khi hình thành [27], [39], [40]. Tuy nhiên, để có được những bằng chứng khoa học thuyết phục hơn về khả năng tạo hạt nano vàng, các dung dịch này cần được phân tích sâu hơn bằng các kỹ thuật hiện đại.
Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ natri citrate đối với sự hình thành hạt nano vàng. Giữ nguyên mức điện áp 9V và thay đổi nồng độ natri citrate trong dải 0,08% - 0,12%, với thay đổi nhỏ 0,02%. Sau 2 giờ chế tạo, màu trong bình chế tạo với nồng độ natri citrate ở 0,12% là đậm nhất, nhưng không khác biệt nhiều so với hai mẫu còn lại khi chế tạo với natri citrate ở nồng độ thấp hơn tương ứng 0,1% và 0,08% (Hình 3.2).
Để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chế tạo, lựa chọn và giữ ổn định điện áp ở 9V, nồng độ natri citrate 0,1%. Sau đó, quan sát sự thay đổi màu sắc theo thời gian chế tạo, kết quả cho thấy thời gian chế tạo càng lâu thì màu sắc dung dịch càng đậm (Hình 3.3).
Hình 3.3.Thay đổi màu sắc trong dung dịch nano vàng theo thời gian chế tạo Như vậy, quan sát bằng mắt thường quá trình chế tạo nano vàng từ vàng khối cho thấy rằng màu sắc dung dịch thay đổi từ trắng trong sang hồng đậm tùy thuộc vào điện áp, nồng độ natri citrate và thời gian chế tạo. Điều này có thể giải thích rằng đã có sự hình thành các hạt nano vàng trong dung dịch, và màu của dung dịch là do sự cộng hưởng plasmon bề mặt của các hạt nano vàng tạo thành [40], [41]. Tuy nhiên, để có những bằng chứng khoa học chính xác để khẳng định chính xác sự hình thành hạt nano vàng chế tạo bằng phương pháp này cần sử dụng những phép phân tích hiện đại hơn như UV-vis hay TEM.
3.1.2. Sự hình thành nano vàng khảo sát bằng UV-vis.
0,1% và thời gian chế tạo 2 giờ. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có đỉnh hấp thụ ở bước sóng trong dải 528 nm – 538 nm, điều này đã khẳng định sự hình thành hạt nano vàng trong dung dịch (Hình 3.4). Hay có kết luận rằng phổ UV-vis đã xác nhận rằng nano vàng hoàn toàn có thể được chế tạo trong nước cất từ vàng khối [42], [43], [44]. Cụ thể, mẫu chế tạo với điện áp 6V cho đỉnh hấp thụ tại bước sóng 528 nm; 9V tại bước sóng 529 nm; 12V tại bước sóng 531 nm và 15V tại bước sóng 532 nm. Trong cùng một điều kiện thí nghiệm và đo đạc, các đỉnh phổ hấp thụ có cường độ thay đổi phụ thuộc vào giá trị điện áp sử dụng, điện áp càng cao thì cường độ đỉnh càng cao, đỉnh có xu hướng lệch về phía bước sóng dài. Tuy nhiên, sự dịch chuyển này không đáng kể, điều này đồng nghĩa với việc kích thước của các hạt nano vàng có sự khác biệt, nhưng không đáng kể khi chế tạo tại các điện áp khác nhau đã khảo sát. Hơn nữa, đỉnh phổ nhọn và không xuất hiện đỉnh phụ, điều này chứng tỏ hạt rất tập trung ở một dải kích thước hẹp xác định nào đó [42], [44]. Ảnh hưởng của điện thế tới sự hình thành hạt có thể giải thích rằng khi cấp một dòng điện một chiều vào điện cặp điện cực, các ion vàng bị bứt phát ra khỏi anot để tiến về catot nhận 3 điện tử tạo thành nguyên tử vàng. Do có động năng quay trong dung dịch, các nguyên tử bám dính không chắc chắn trên điện catot dễ dàng bị bứt ra và đi vào dung dịch. Các nguyên tử sẽ tập hợp lại trong dung dịch tạo thành hạt nano để đạt trạng thái năng lượng bền vững hơn.
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri citrate tới sự hình thành của hạt nano vàng, mức điện áp trung gian 9V được lựa chọn và natri citrate được thay đổi nồng độ ở 3 mức khác nhau 0,02% (từ 0,08% - 0,12%). Kết quả phân tích UV-vis đối với mẫu sau khi chế tạo 2 giờ cho thấy, cả 3 mẫu đều cho đỉnh hấp thụ ở bước sóng lần lượt là 528 nm (0,08%); 529 nm (0,1%) và 533 nm (0,12%). Mặc dù, đỉnh hấp thụ có xu hướng dịch chuyển về phía bước sóng dài khi tăng nồng độ natri citrate, tuy nhiên, sự dịch chuyển này không đáng kể. Như vậy, với nồng độ natri citrate nhỏ dao động xung quanh 0,1% không ảnh hưởng nhiều đến sự hình thành