Tác hại của Fluoroquinolone đến mụi trƣờng

c. ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)

1.6. Tác hại của Fluoroquinolone đến mụi trƣờng

Vừa qua, một nghiờn cứu của Phú giáo sƣ, Tiến sĩ (PGS-TS) Nguyễn Đỡnh Tuấn, nguyờn Hiệu trƣởng Trƣờng đại học Tài nguyờn và Mụi trƣờng TP HCM cựng các cộng sự (2014) cho thấy vựng hạ lƣu sụng Sài Gũn - Đồng Nai đó xuất hiện dƣ lƣợng kháng sinh, nhiều nơi vƣợt quá tiờu chuẩn cho phộp. Hiện nay, nƣớc ở hạ lƣu sụng Sài Gũn - Đồng Nai là nguồn nƣớc thụ sau khi xử lý, đƣợc dựng để cung cấp cho sinh hoạt của ngƣời dõn ở thành phố Hồ Chớ Minh.

Các kết quả nghiờn cứu, đó cho thấy sự hiện diện của dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc thải của một số các cụng ty, xớ nghiệp cũng nhƣ trong nƣớc sụng Sài Gũn - Đồng Nai ở vựng hạ lƣu. Đối với, dƣ lƣợng kháng sinh nhúm Fluoroquinolone là 41% trong mẫu nƣớc, 58% trong mẫu bựn, trầm tớch, trong lỳc quy trỡnh xử lý nƣớc thải hiện nay chƣa thể giải quyết vấn đề này, dƣ lƣợng kháng sinh sẽ tồn lƣu và tiếp tục di chuyển ra mụi trƣờng, sụng suối...Tác hại của kháng sinh nhúm Fluoroquinolone đƣợc cho là cú nguy cơ gõy đột biến gien, gõy sẩy thai khi sử

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

32

dụng cho động vật mang thai. Bờn cạnh đú, sự tồn lƣu trong thời gian dài sau khi sử dụng Fluoroquinolone cũng là nguyờn nhõn dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhúm này.

Thật ra, về mặt sinh húa Fluoroquilone khụng phải là những chất mới nhƣng theo các chuyờn gia mụi trƣờng thỡ nú đƣợc xếp vào nhúm các chất gõy "ụ nhiễm mới" vỡ sự hiện diện của nú trong nguồn nƣớc thải sinh hoạt, cụng nghiệp hoặc nụng nghiệp, chảy ra sụng, hồ, cú khả năng gõy ra các tác động tiờu cực đến con ngƣời và hệ sinh thái. Nguy hiểm nhất là khi đổ vào sụng, hồ, rồi nƣớc sụng hồ đƣợc xử lý thành nƣớc sinh hoạt thỡ rất ớt ngƣời nhận biết đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh vỡ hàm lƣợng của nú rất nhỏ. Nhƣng một khi đó xõm nhập vào cơ thể ngƣời, Fluoroquinolone gõy ảnh hƣởng sức khỏe con ngƣời.

1.5. Các nghiờn cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng ELISA phát hiện dƣ lƣợng Fluoroquilone

1.5.1. Các nghiờn cứu ngoài nƣớc

Jiang và c ộng sự (2011) đó phát triển và tối ƣu húa phƣơng pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp (icELISA) phát hiện dƣ lƣợng Norfloxacin (NFL) trong gan gà. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để tổng hợp các kháng nguyờn nhõn tạo NFL - BSA, lớp phủ kháng nguyờn của NFL - OVA và thỏ đó đƣợc sử dụng để sản xuất các kháng thể đa dũng kháng NFLX. Phƣơng pháp icELISA để phát hiện định lƣợng NFL trong gan gà. Phạm vi phát hiện là 0,006 - 38 ng/ml, với giá trị LOD và IC50

tƣơng ứng là 0,004 ng/ml và 0,48 ng/ml. Ngoại trừ cho một phản ứng chộo cao để Ciprofloxacin (38%) và Sarafloxacin (33%). Sau khi tối ƣu húa, pha loóng 10 lần trong chiết xuất gan gà đó đƣa ra một đƣờng cong ức chế gần nhƣ tƣơng tự nhƣ trong PBS đệm. Khi tăng vọt trong chiết xuất gan ở mức 8, 20, và 50 ng/ml, tỷ lệ thu hồi là 90 - 117,8% giữa các thớ nghiệm, 97,5 - 114,4% cho các thớ nghiệm tƣơng ứng. Các độ lệch chuẩn tƣơng đối dao động 5,6 - 9,2% giữa các thớ nghiệm và 5,9 - 11% cho các thớ nghiệm. Do đú, các nƣớc phát triển phƣơng pháp icELISA cú thể đƣợc sử dụng cho việc kiểm tra định lƣợng NFL dƣ lƣợng trong các mụ thịt gà [24].

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

33

Jiang và cộng sự (2010) đó nghiờn cứu phát triển một xột nghiệm miễn dịch xác dịch Fluoroquinolones chất gõy ụ nhiễm trong mụi trƣờng nƣớc. Với mục đớch này, cụng nghệ NHS este sử dụng để tổng hợp các immunogen và lớp phủ kháng nguyờn Sarafloxacin (SAR). SDS - PAGE, quang phổ tia cực tớm cú thể nhỡn thấy và xác định quang phổ hồng ngoại cho thấy rằng kháng nguyờn nhõn tạo đó đƣợc phức hợp thành cụng. Phƣơng pháp icELISA đƣợc xác định. Các phạm vi hoạt động trong thớ nghiện đó đƣợc xác định là 0,048 - 62,4 ng/ml, với LOD và IC50 giá trị tƣơng ứng là 0,018 ng/ml và 2,5 ng/ml. Thớ nghiệm này cho thấy một phản ứng chộo cao Difloxacin (86,7%), Norfloxacin (63,2%) và Pefloxacin (33,8%). Khi áp dụng trong nƣớc máy, nƣớc sụng và mẫu nƣớc nuụi trồng thủy sản, cho Sarafloxacin, Difloxacin, Norfloxacin và Pefloxacin là 89,5 - 119,5, 90.5 - 121,2, 92,1 - 118,6, và 88,2 - 116,8%, tƣơng ứng với hệ số biến thiờn (CV) giá trị tất cả < 10%. Kết quả thớ nghiệm này cú thể đƣợc sử dụng để phát hiện đồng thời Sarafloxacin, Difloxacin, Norfloxacin, và Pefloxacin dƣ lƣợng trong mẫu nƣớc [25].

Huang và cộng sự (2014) đó nghiờn cứu phát triển phƣơng pháp ELISA gián tiếp cạnh tranh để phát hiện dƣ lƣợng Danofloxacin trong sữa. DFL đó đƣợc sử dụng nhƣ là một hapten đƣợc kết hợp với albumin huyết thanh bũ (BSA) và BSA - DFL đó đƣợc hỡnh thành. Những con thỏ đƣợc gõy miờ̃n di ̣ch với hapten và thu đƣợc kháng thể kháng DFL tƣ̀ huyờ́t thanh thỏ. Các khảo nghiệm đƣợc cải thiện hiệu suất bằng cách sử dụng một kháng nguyờn lớp phủ (DFL - OVA) là một liờn hợp của DFL và Ovalbumin (OVA). Cuối cựng, việc xác định dƣ lƣợng DFL bởi icELISA đó đƣợc nghiờn cứu. Các kết quả của thớ nghiệm đó chứng minh rằng giới hạn phát hiện (LOD) cho DFL là 29,24 àg/kg. Bờn cạnh đú, các kháng thể đặc hiệu phản ứng liờn quan chặt chẽ với FQNs, bao gồm Ciprofloxacin (CIP), Ofloxacin (OFL), Sarafloxacin (SAL) và Enrofloxacin (EFL). Tỷ lệ thu hồi trung bỡnh của chất chuẩn (DFLX) là 91,45% với tỷ lệ của 0,5 ~ 2000 àg/kg trong sữa, phƣơng pháp này đƣợc nghiờn cứu để ứng dụng xác định DFL trong sữa [26].

ZHANG và cộng sự (2011) đó nghiờn cứu phát triển gián tiếp ELISA cạnh tranh phát hiện đồng thời Enrofloxacin và Ciprofloxacin. Đƣợc thay đổi 1 - etyl - 3

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

34

(3-dimethylaminopropy) carbodiimit (EDC) phƣơng pháp đó đƣợc sử dụng để tổng hợp kháng nguyờn nhõn tạo của Enrofloxacin (ENR) và thỏ New Zealand đó đƣợc sử dụng để sản xuất kháng thể đa dũng kháng - ENR (pAb). Dựa trờn các chuẩn độ, icELISA đƣợc lập thành đƣờng cong chuẩn. Xột nghiệm này đó cú một cấp bậc tuyến tớnh 6 - 148,0 àg/kg (R2 = 0,9567) với một nửa nồng độ tối đa ức chế (IC50) và giới hạn phát hiện (LOD) giá trị tƣơng ứng là 9,4 àg/kg và 0,2 àg/kg. Các pAb cú phản ứng chộo cao với Ciprofloxacin (CIP) (87%), các chất chuyển húa chớnh của ENR ở các mụ. Sau khi tối ƣu húa, các hiệu ứng ma trận cú thể đƣợc bỏ qua bằng cách sử dụng một lần 10x pha loóng trong thịt bũ và pha loóng 20x lần trong thịt lợn. Sự phục hồi tổng thể và hệ số biến thiờn (CV) trong phạm vi tƣơng ứng là 86% - 109% và 6,8% - 13,1%. Cú thể kết luận phƣơng pháp ELISA đƣợc xõy dựng phự hợp cho phát hiện đồng thời ENR và CIP trong mụ động vật [27].

1.5.2. Các nghiờn cứu trong nƣớc

Phạm Kim Đăng và c ộng sự (2008) đã ƣ́ng du ̣ng phƣơng phá p ELISA đờ̉ phõn tích tụ̀n dƣ kháng sinh nhóm Quinolone trong tụm ta ̣i mụ ̣t sụ́ tỉnh ven biờ̉n khu vƣ̣c phía Bắc qua viờ ̣c phõn tích 90 mõ̃u tụm đƣợc lṍy ở 4 đi ̣a phƣơng đa ̣i diờ ̣n (Hà Nội , Quảng Ninh , Nam Định và Nghờ ̣ An ). Kờ́t quả phõn tớch sử dụng Kit ELISA (Cer, Bỉ) thu đƣợc cho thṍy Kit ụ̉n đi ̣nh và c ho ngƣỡng phát hiờ ̣n 0,7 ppb. Kờ́t quả phát hiện tồn dƣ 5 loại Quinolone (Enrofloxacin, Norfloxacin, Cipfloxacin, Danofloxacin và Acid oxolinic) trong mõ̃u với nụ̀ng đụ ̣ d ao đụ ̣ng tƣ̀ 0,4 - 145 ppb, và kết quả này đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS/MS) [9].

Các nhà khoa học thuộc phũng thớ nghiệm cụng nghệ sinh học, Trung tõm nghiờn cứu triển khai, khu cụng nghệ cao thành phố Hồ Chớ Minh vừa cụng bố hoàn thành nghiờn cứu bộ kit ELISA phát hiện nhanh dƣ lƣợng kháng sinh Enrofloxacin trong thủy sản. Theo Thạc sỹ Bựi Quốc Anh, tác giả của sản phẩm, thỡ bộ kit này dựa trờn cơ chế miễn dịch cạnh tranh giữa chất kháng sinh Enrofloxacin và cộng hợp enzyme đánh dấu lờn kháng thể đặc hiệu. Nồng độ Enrofloxacin sẽ đƣợc hiển thị dựa trờn mức độ phát quang của enzyme. Do đú, chỉ

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

35

cần căn cứ vào cƣờng độ hiện màu của giếng thử là cú thể xác định đƣợc mẫu thủy sản cú nhiễm Enrofloxacin hay khụng và nhiễm với nồng độ bao nhiờu. Tất cả các quy trỡnh từ đƣa mẫu vào phõn tớch đến cho ra kết quả chỉ mất 30 phỳt, nhanh hơn rất nhiều so với các phƣơng pháp khác. Bộ kit cú độ nhạy cao, cú khả năng phát hiện dƣ lƣợng Enrofloxacin ở ngƣỡng phát hiện 1 ppb và cú thể phõn tớch từ 50 đến 80 mẫu cựng một lỳc. Ngoài ra, bộ kớt này cũn cú các ƣu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, khụng đũi hỏi các thiết bị đắt tiền, khụng cần nhõn viờn cú chuyờn mụn cao.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

36

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiờn cứu

2.1.1. Dụng cụ, thiết bị

Thiết bị Hãng

Máy đọc ELISA Bio Rad 550, Đức Đĩa ELISA M96V MaxiSorp, Đức

MáyVortex Janke & Kunkel, Đức Máy ly tõm 5415C Eppendorf, Đức Máy đo pH WTW

Cõn phõn tớch Shimadzu, Nhật Máy lắc S20 Đức

Máy khuấy từ VELP Scientifica Micro pipet Eppendorf, Đức Các loại dụng cụ thuỷ tinh Việt Nam.

2.1.2. Hoá chất

Tờn hoá chất Hãng

Rabbit anti-Mouse IgG Secondary Antibody Sigma - Aldrich - HRP conjugate (rAnti-IgG-HRP)

Levofloxacin (LEV) Sigma - Aldrich Ofloxacin (OFL) Sigma - Aldrich Garenoxacin (GAR) Sigma - Aldrich Rufloxacin (RUF) Sigma - Aldrich 3,3’,5,5’ Tetramethylbezidine (TMB) Sigma - Aldrich Albumin huyết thanh bũ (BSA) Sigma - Aldrich Ovalbumin (OVA) Sigma - Aldrich N,N - dimethyl foromamide (DMF) Sigma - Aldrich

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

37

N,N - dicychlohexyl cacbodyimide (DDC) Sigma - Aldrich N,N - hydroxy succinimide (NHF) Sigma – Aldrich Và một số hoá chất chuyờn dụng khác

2.1.3. Các dung dịch đệm

 Đệm PBS 80 mM pH7,2 (10x) 1000 ml (Phosphate buffer saline)

Na2HPO4 12H2O 24,34 g NaH2PO4 2H2O 1,44 g NaCl 8,5 g Thờm nƣớc cất 2 lần đến thể tớch 1000 ml Chỉnh pH dến 7,2 bằng HCl 37%  Đệm PBST 8 mM pH 7,2 (1x) 1000 ml (Phosphate buffer saline Tween)

Đệm PBS 80 mM pH 7,2 100 ml Tween 20 0,5 ml Thờm nƣớc cất 2 lần đến thể tớch 1000 ml  Đệm PBS 8 mM pH 7,2 (1x) 1000 ml Đệm PBS 80 mM pH7,2 100 ml Thờm nƣớc cất 2 lần đến thể tớch 1000 ml  Đệm Sodium acetat 0,1 M pH 5,5 100 ml CH3COONa 1,361 g Thờm nƣớc cất 2 lần đến thể tớch 100 ml

Chỉnh pH đến 5,5 bằng axit citric 0,1 M

 Đệm NaHCO3 0,13 M 100 ml

NaHCO3 1,08 g

Thờm nƣớc cất 2 lần đến thể tớch 100 ml

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

38  Dung dịch hiện màu

TMB (6 mg/ml pha trong DMSO) 400 àl H2O2 1% (v/v) 100 àl Đệm Sodium acetate 0,1 M pH 5,5 25 ml

 Dung dịch (NH4)2SO4 bóo hoà

 Dung dịch H2SO4 2N

2.2. Phƣơng pháp nghiờn cứu 2.2.1. Mục tiờu của nghiờn cứu 2.2.1. Mục tiờu của nghiờn cứu

Xõy dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiờ́p xác đi ̣nh dƣ lƣợng kháng sinh LEV trong sƣ̃a trong điờ̀u kiờ ̣n phòng thí nghiờ ̣m.

2.2.2. Địa điểm và đụ́i tƣợng nghiờn cứu

 Địa điểm:

1 - Nghiờn cứu đƣợc tiến hành tại Phũng Thớ nghiệm Cụng nghệ Gen động vật - Viện Cụng nghệ sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. 2 - Phũng thớ nghiệm Húa enzyme, Khoa Húa, Trƣờng ĐH Quốc gia Lomonosov, CHLB Nga.

 Mẫu sữa: Sƣ̃a tƣơi thu mua tại các điểm kinh doanh quanh Hà Nội (Ba Vỡ, Sơn Tõy).

2.2.3. Phƣơng pháp nghiờn cứu 2.2.3.1. Nụ̣i dung nghiờn cứu 2.2.3.1. Nụ̣i dung nghiờn cứu

a. Phƣơng phá p tụ̉ng hơ ̣p hapten gắn LEV với OVA/BSA

Kháng thể khụng hỡnh thành nếu kớch thớch miễn dịch bằng các kháng nguyờn cú trọng lƣợng phõn tử thấp (khoảng 2.000 Da). Do đú, các phức hợp (hapten) của LEV với một chất cú trọng lƣợng phõn tử cao (protein) đƣợc tổng hợp. Một nhúm cacboxylic phản ứng xảy ra trong Fluoroquinolones. Tiờm chủng phức hợp với

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

39

cationized albumin huyết thanh bũ (BSA) đó đƣợc tổng hợp, cho hấp thụ trong các giếng, các phức hợp của LEV với OVA đó đƣợc tổng hợp [28 - 29].

Bƣớc thứ nhất là sự kớch hoạt của nhúm carboxylic: Fluoroquinolone, 1-etyl 3(dimetylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC) và N- hydroxysuccinimide (NHS) đƣợc hũa tan trong dimethylformamid (DMF) và ủ.

Bƣớc thứ hai hũa tan của protein (OVA/BSA) trong đệm carbonate (pH 9,5) và ủ trong 1h ở nhiệt độ 4o

C.

Bƣớc thứ ba là việc bổ sung các LEV để kớch hoạt dung dịch protein và lắc nhẹ, ủ ở nhiệt độ phũng.

Bƣớc thứ tƣ là sự thẩm tớch các chất thừa khụng phản ứng cú trọng lƣợng phõn tử thấp bằng cách thẩm tớch trong nƣớc 3 - 5 ngày.

Cuối cựng chia nhỏ phức hợp thu đƣợc thành lƣợng nhỏ và lƣu trữ ở - 20oC. Các bƣớc tiến hành tổng hợp hapten gắn LEV với BSA/OVA.

- Hoạt húa LEV: Hoà tan 15 àmol LEV + 30 àmol EDC + 30 àmol NHS trong 1 ml dimethyformamide (DMF). Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ trong 2 h.

- Phản ứng gắn BSA/OVA với LEV: Nhỏ từng giọt LEV vào dung dịch BSA/OVA đó hoạt húa trong ống cú khuấy sau đú cho thẩm tớch (qua tỳi kớch thƣớc lỗ nhỏ cú khả năng thấm một chiều), cho phộp các chất (muối) cú trọng lƣợng phõn tử thấp thấm ra ngoài, thu dịch bờn trong tỳi thẩm tớch.

- Sử dụng LEV- cBSA để gõy miễn dịch trờn thỏ.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

40

- Chất phủ kháng nguyờn: LEV-N-C5-CO-N-OVA

Hỡnh 12. Tổng hợp liờn hợp của LEV với OVA (LEV - OVA) b. Phƣơng phá p ta ̣o kháng thờ̉ đa dòng kháng LEV trờn thỏ

éể cú đƣợc kháng thể đa dũng, lớp nhũ tƣơng của liờn hợp với chất bổ trợ complete Freund’s trong dung dịch đƣợc chuẩn bị cho các miễn dịch đầu tiờn và với chất khụng bổ trợ incomplete Freund’s cho các tiờm chủng tiếp theo. Lớp nhũ tƣơng đƣợc sử dụng để tiờm chủng cho thỏ tại 10 - 15 địa điểm dọc theo cột sống. Tiờm chủng đƣợc lặp lại tại một thời gian nhất định trong chu trỡnh miễn dịch. Sau nhiều chu kỳ miễn dịch, lấy mẫu máu từ các tĩnh mạch sau lỗ tai. Sau đú, huyết thanh thu đƣợc, ngƣời ta cú thể thực hiện kết tủa bằng dung dịch bóo hũa của ammonium sulfate để cụ lập các phần IgG. Các kháng thể thu đƣợc đƣợc đụng khụ hoặc bảo quản với 1 : 1 glycerol và bảo quản ở - 20oC.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

41

Tiến hành chuẩn bị tạo khỏng thể đa dũng

Kháng thể đa dũng thu đƣợc trờn những con thỏ của giống California ở 3 tháng tuổi. Việc tiờm chủng đó đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian hai tuần của nhũ tƣơng tƣơi chuẩn bị (liờn hợp 1 - 2 mg trong nƣớc) cho tiờm với chất bổ trợ complete Freund’s tại nhiều địa điểm (lờn đến 15 địa điểm) dọc theo cột sống. Vào ngày thứ 8, sau mỗi lần tiờm thứ ba, lấy mẫu máu đó đƣợc thực hiện từ các tĩnh mạch nhĩ phớa sau lỗ tai bằng cách sử dụng ống nghiệm chõn khụng với gel và chất đụng máu. Các huyết thanh đó đƣợc phõn lập bằng cách ly tõm, và đƣợc tinh chế bằng kết tủa gấp ba lần bằng 50% ammonium sulfate ở +4oC để cung cấp cho các phần kháng thể IgG, đƣợc hũa tan trong đệm phosphate.Các immune globulin phần thu đƣợc đó đƣợc pha trộn với glycerol ở tỉ lệ 1:1 và bảo quản ở - 20oC thu đƣợc kháng thể (Ab).

c. Phƣơng pháp ELISA giá n tiờ́p xác đi ̣nh dƣ lƣơ ̣ng LEV

Nguyờn lý xác định LEV dựa trờn phản ứng miễn dịch cạnh tranh ELISA, nhờ tớnh chất nhận biết đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyờn và khả năng tạo phức hợp giữa kháng thể và một enzym. Sử dụng kháng thể đa dũng kháng LEV trong phản ứng cạnh tranh giữa LEV tự do cú trong mẫu và LEV-OVA gắn trờn bề mặt giếng. LEV trong các mẫu kiểm tra cạnh tranh với phức hợp LEV-OVA cố