Phƣơng pháp nghiờn cứu

c. ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)

2.2. Phƣơng pháp nghiờn cứu

2.2.1. Mục tiờu của nghiờn cứu

Xõy dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiờ́p xác đi ̣nh dƣ lƣợng kháng sinh LEV trong sƣ̃a trong điờ̀u kiờ ̣n phòng thí nghiờ ̣m.

2.2.2. Địa điểm và đụ́i tƣợng nghiờn cứu

 Địa điểm:

1 - Nghiờn cứu đƣợc tiến hành tại Phũng Thớ nghiệm Cụng nghệ Gen động vật - Viện Cụng nghệ sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. 2 - Phũng thớ nghiệm Húa enzyme, Khoa Húa, Trƣờng ĐH Quốc gia Lomonosov, CHLB Nga.

 Mẫu sữa: Sƣ̃a tƣơi thu mua tại các điểm kinh doanh quanh Hà Nội (Ba Vỡ, Sơn Tõy).

2.2.3. Phƣơng pháp nghiờn cứu 2.2.3.1. Nụ̣i dung nghiờn cứu 2.2.3.1. Nụ̣i dung nghiờn cứu

a. Phƣơng phá p tụ̉ng hơ ̣p hapten gắn LEV với OVA/BSA

Kháng thể khụng hỡnh thành nếu kớch thớch miễn dịch bằng các kháng nguyờn cú trọng lƣợng phõn tử thấp (khoảng 2.000 Da). Do đú, các phức hợp (hapten) của LEV với một chất cú trọng lƣợng phõn tử cao (protein) đƣợc tổng hợp. Một nhúm cacboxylic phản ứng xảy ra trong Fluoroquinolones. Tiờm chủng phức hợp với

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

39

cationized albumin huyết thanh bũ (BSA) đó đƣợc tổng hợp, cho hấp thụ trong các giếng, các phức hợp của LEV với OVA đó đƣợc tổng hợp [28 - 29].

Bƣớc thứ nhất là sự kớch hoạt của nhúm carboxylic: Fluoroquinolone, 1-etyl 3(dimetylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC) và N- hydroxysuccinimide (NHS) đƣợc hũa tan trong dimethylformamid (DMF) và ủ.

Bƣớc thứ hai hũa tan của protein (OVA/BSA) trong đệm carbonate (pH 9,5) và ủ trong 1h ở nhiệt độ 4o

C.

Bƣớc thứ ba là việc bổ sung các LEV để kớch hoạt dung dịch protein và lắc nhẹ, ủ ở nhiệt độ phũng.

Bƣớc thứ tƣ là sự thẩm tớch các chất thừa khụng phản ứng cú trọng lƣợng phõn tử thấp bằng cách thẩm tớch trong nƣớc 3 - 5 ngày.

Cuối cựng chia nhỏ phức hợp thu đƣợc thành lƣợng nhỏ và lƣu trữ ở - 20oC. Các bƣớc tiến hành tổng hợp hapten gắn LEV với BSA/OVA.

- Hoạt húa LEV: Hoà tan 15 àmol LEV + 30 àmol EDC + 30 àmol NHS trong 1 ml dimethyformamide (DMF). Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ trong 2 h.

- Phản ứng gắn BSA/OVA với LEV: Nhỏ từng giọt LEV vào dung dịch BSA/OVA đó hoạt húa trong ống cú khuấy sau đú cho thẩm tớch (qua tỳi kớch thƣớc lỗ nhỏ cú khả năng thấm một chiều), cho phộp các chất (muối) cú trọng lƣợng phõn tử thấp thấm ra ngoài, thu dịch bờn trong tỳi thẩm tớch.

- Sử dụng LEV- cBSA để gõy miễn dịch trờn thỏ.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

40

- Chất phủ kháng nguyờn: LEV-N-C5-CO-N-OVA

Hỡnh 12. Tổng hợp liờn hợp của LEV với OVA (LEV - OVA) b. Phƣơng phá p ta ̣o kháng thờ̉ đa dòng kháng LEV trờn thỏ

éể cú đƣợc kháng thể đa dũng, lớp nhũ tƣơng của liờn hợp với chất bổ trợ complete Freund’s trong dung dịch đƣợc chuẩn bị cho các miễn dịch đầu tiờn và với chất khụng bổ trợ incomplete Freund’s cho các tiờm chủng tiếp theo. Lớp nhũ tƣơng đƣợc sử dụng để tiờm chủng cho thỏ tại 10 - 15 địa điểm dọc theo cột sống. Tiờm chủng đƣợc lặp lại tại một thời gian nhất định trong chu trỡnh miễn dịch. Sau nhiều chu kỳ miễn dịch, lấy mẫu máu từ các tĩnh mạch sau lỗ tai. Sau đú, huyết thanh thu đƣợc, ngƣời ta cú thể thực hiện kết tủa bằng dung dịch bóo hũa của ammonium sulfate để cụ lập các phần IgG. Các kháng thể thu đƣợc đƣợc đụng khụ hoặc bảo quản với 1 : 1 glycerol và bảo quản ở - 20oC.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

41

Tiến hành chuẩn bị tạo khỏng thể đa dũng

Kháng thể đa dũng thu đƣợc trờn những con thỏ của giống California ở 3 tháng tuổi. Việc tiờm chủng đó đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian hai tuần của nhũ tƣơng tƣơi chuẩn bị (liờn hợp 1 - 2 mg trong nƣớc) cho tiờm với chất bổ trợ complete Freund’s tại nhiều địa điểm (lờn đến 15 địa điểm) dọc theo cột sống. Vào ngày thứ 8, sau mỗi lần tiờm thứ ba, lấy mẫu máu đó đƣợc thực hiện từ các tĩnh mạch nhĩ phớa sau lỗ tai bằng cách sử dụng ống nghiệm chõn khụng với gel và chất đụng máu. Các huyết thanh đó đƣợc phõn lập bằng cách ly tõm, và đƣợc tinh chế bằng kết tủa gấp ba lần bằng 50% ammonium sulfate ở +4oC để cung cấp cho các phần kháng thể IgG, đƣợc hũa tan trong đệm phosphate.Các immune globulin phần thu đƣợc đó đƣợc pha trộn với glycerol ở tỉ lệ 1:1 và bảo quản ở - 20oC thu đƣợc kháng thể (Ab).

c. Phƣơng pháp ELISA giá n tiờ́p xác đi ̣nh dƣ lƣơ ̣ng LEV

Nguyờn lý xác định LEV dựa trờn phản ứng miễn dịch cạnh tranh ELISA, nhờ tớnh chất nhận biết đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyờn và khả năng tạo phức hợp giữa kháng thể và một enzym. Sử dụng kháng thể đa dũng kháng LEV trong phản ứng cạnh tranh giữa LEV tự do cú trong mẫu và LEV-OVA gắn trờn bề mặt giếng. LEV trong các mẫu kiểm tra cạnh tranh với phức hợp LEV-OVA cố định cú trờn giếng để gắn vào vựng liờn kết kháng nguyờn của kháng thể đa dũng đặc hiệu kháng LEV (tạo trong thỏ). Sau đú, kháng thể thứ 2 đƣợc sử dụng là phức hợp kháng thể kháng huyết thanh thỏ tạo trong chuột đƣợc đánh dấu enzyme HRP (Rabbit anti - Mouse IgG Secondary Antibody - HRP conjugate). Tớn hiệu màu sẽ xuất hiện trờn phiến nhựa khi xảy ra phản ứng giữa enzym trong phức hợp kháng thể thứ 2 với cơ chất TMB đƣợc đƣa vào. Hàm lƣợng LEV trong mẫu tỷ lệ nghịch với cƣờng độ màu, cú nghĩa là những mẫu chứa lƣợng LEV lớn, đồng nghĩa với việc HRP đƣợc gắn trờn phiến nhỏ, sẽ cho cƣờng độ màu yếu (gọi là mẫu dƣơng tớnh hay mẫu cú hàm lƣợng LEV cao). Những mẫu chứa lƣợng LEV nhỏ (hoặc khụng cú), lƣợng HRP đƣợc gắn trờn phiến lớn sẽ cho cƣờng độ màu cao tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp mẫu chuẩn (gọi là mẫu õm tớnh hay mẫu cú hàm lƣợng LEV thấp).

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

42

Dựng đồ thị chuẩn xỏc định hàm lượng LEV

Đồ thị chuẩn đƣợc xõy dựng dựa trờn kết quả đo mật độ quang học OD450

của phản ứng ELISA. Các bƣớc thực hiện phản ứng nhƣ sau:

Bƣớc 1: Phủ 200 àl LEV-OVA nồng độ 0,5àg/ml trong dung dịch đệm PBS 80mM pH 7,2 vào mỗi giếng của phiến nhựa, ủ qua đờm ở 40C. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng đệm PBST1x.

Bƣớc 2: Phủ 50 àl kháng thể đa dũng kháng LEV (độ pha loóng 5.000x) vào các giếng. Thờm 50 àl mẫu chứa LEV ở các nồng độ khác nhau pha trong đệm PBS 80 mM. Ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phũng trong 1 giờ. Rửa phiến nhựa 2 lần bằng PBST và 1 lần bằng PBS 8 mM pH 7,2.

Bƣớc 3: Bổ xung thờm 200 àl cộng hợp kháng thể thứ 2 (Rabbit anti-mouse IgG Secondary Antibody - HRP conjugate) ở nồng độ pha loóng 10.000 lần trong đệm PBS 80 mM pH 7,2 vào mỗi giếng. Ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phũng trong 1 giờ và cú lắc nhẹ. Rửa bản nhựa 3 lần bằng dung dịch đệm PBST.

Bƣớc 4: Phủ vào mỗi giếng 200 àl dung dịch hiện màu (TMB ), ủ trong tối 30 phỳt ở nhiệt độ phũng. Sau đú dừng phản ứng với 50 àl dung dịch H2SO4 2N.

Bƣớc 5: Đọc kết quả ở bƣớc súng 450 nm bằng máy đọc ELISA.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

43

Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp cạnh tranh

Khá ng nguyê n (LEV-OVA) Phản ứng miễn dịch cạ nh tranh Hỗn hợ p pAb-LEV Rửa Ab d- thừa khỏi giá gắn pAb gắn đặc hiệu vớ i LEV-OVA Giếng ELISA 3 2 1 1. Cố định khá ng nguyê n

(LEV-OVA) lê n bề mặt giếng

2. Bổ sung hỗn hợ p pAb-LEV và mẫu cần xá c định.

LEV: Phản ứng miễn dịch cạ nh tranh giữa khá ng nguyê n LEV cố định trê n phiến và LEV tự do có trong mẫu vớ i pAb

3. Rửa sạ ch Ab d- thừa khỏi giá gắn, trê n giá còn lạ i pAb gắn đặc hiệu vớ i LEV-OVA Cố định khá ng nguyê n (LEV-OVA) LEV mẫu khá ng thể (rAnti-IgG-HRP) 6. L- ợ ng LEV tỷ lệ vớ i c- ờng độ Cơ chất enzyme Phản ứng lê n màu S S S S S S

Giếng có nhiều LEV Giếng có ít LEV

4

5

4. Phủ cộng hợ p khá ng thể thứ 2 (rAnti-IgG-HRP)

5. Cho cơ chất enzyme để lê n màu

6

S

Hỡnh 13. Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

44

2.2.3.2. Giới hạn phát hiện nồng đụ̣ và đụ̣ đặc hiệu của nghiờn cứu

Để xác định đặc tớnh phõn tớch, chƣơng trỡnh Origin 8.5 đƣợc sử dụng để xử lý kết quả. Sự phụ thuộc của các dấu hiệu tƣơng đối logarit với nồng độ đƣợc vẽ, phần tuyến tớnh đó đƣợc xác định và một phƣơng trỡnh tuyến tớnh với hệ số xấp xỉ thu đƣợc. Các giới hạn của nồng độ cú thể phát hiện đƣợc coi là nồng độ mà tại đú các dấu hiệu phõn tớch giảm 10%. Tức là, thay đổi từ đú dấu hiệu ở nồng độ bằng khụng.

Phạm vi của các nồng độ phát hiện là phạm vi của sự suy giảm tuyến tớnh của dấu hiệu. Điều này thƣờng là các phần của chuẩn tƣơng ứng với 20 - 80% của sự khác biệt giữa nồng độ tối đa của chất và giá trị của dấu hiệu hấp thụ.

Các kớ tự cụ thể của quy trỡnh đƣợc ƣớc tớnh bằng các phản ứng chộo với các chất khác.

Tỷ lệ phản ứng chộo đƣợc xác định bằng các phƣơng trỡnh sau đõy:

CR, % = IC50 (LEV)/IC50(X), Trong đú:

IC50 (LEV) là nồng độ của LEV mà tại đú dấu hiệu hấp thụ 50% xảy ra. IC50(X) là nồng độ của các chất phản ứng chộo mà tại đú mức giảm của dấu

hiệu hấp thụ 50%.

2.2.3.3. Đánh giá hiệu suất thu hồi của LEV khi gõy nhiễm nhõn tạo

Kỹ thuật ELISA xỏc định LEV trong cỏc mẫu được nhiễm nhõn tạo

Bƣớc 1: Phủ 200 l LEV-OVA nồng độ 0,5 g/ml trong đệm PBS 80 mM pH 7,2, ủ qua đờm ở 40C. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng dung dịch PBST.

Bƣớc 2: Phủ vào mỗi giếng 50 l dung dịch pAb kháng LEV nồng độ pha loóng 5.000x và 50 l dung dịch LEV đó đƣợc chủ động đƣa vào với với các nồng độ pha loóng từ 0,5; 1,0; 1,5 và 3,0 ng/ml. Ủ phiến nhựa 1 giờ ở nhiệt độ phũng. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng PBST.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

45

Bƣớc 3: Bổ xung 200 l cộng hợp kháng thể 2 đƣợc pha loóng 10.0000 lần trong đệm PBS 80 mM pH 7,2 vào mỗi giếng, ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phũng trong 1 giờ. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng dung dịch PBST.

Bƣớc 4: Thờm 200 l dung dịch hiện màu TMB, ủ tối 30 phỳt ở nhiệt độ phũng. Sau đú dừng phản ứng với 50 l dung dịch H2SO4 2N.

Bƣớc 5: Đọc kết quả ở bƣớc súng 450 nm bằng máy đọc ELISA. Hiệu suất thu hồi LEV đƣợc tớnh theo cụng thức:

%R = (CLEV pƣ/CLEV) x 100%

Trong đú:

R: Hiệu suất thu hồi LEV.

CLEV pƣ: Lƣợng LEV đo đƣợc theo thực tế. CLEV : Lƣợng LEV đƣa vào mẫu.

2.2.3.4. Chuẩn bị mẫu sữa

Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu cú thể khác nhau và thay đổi tựy thuộc vào phƣơng pháp phõn tớch.

- Lấy 2 ml sữa sau đú đƣợc ly tõm trong 30 phỳt ở 10.000 rpm. Mẫu sữa sau khi ly tõm sẽ đƣợc loại bỏ chất bộo ở trờn bằng cách sử dụng pipet hỳt phần sữa bờn dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản.

- Mẫu sữa đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loóng 10 lần.

- Trong các nồng độ đó đƣợc pha loóng đo trực tiếp của Fluoroquinolone trong sữa nguyờn liệu.

Trong nghiờn cứu này, trong các phƣơng pháp loại trừ ảnh hƣởng của chất nền, chỳng tụi so sánh các phƣơng pháp mụ tả ở trờn và các phƣơng pháp cú chất mặn ra sử dụng bóo hoà amoni sulfat. Với việc bổ sung của chất bóo hoà amoni sunfat, các protein kết tủa và một lớp lipid đƣợc hỡnh thành trờn bề mặt. Vỡ vậy, nú

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

46

là cần thiết để cụ lập hơn kết tủa chất lỏng và khụng làm ụ nhiễm các mẫu sữa với chất bộo. Chỳng tụi đó chuẩn bị một loạt các độ pha loóng và xác định mức độ pha loóng cần thiết để loại bỏ hoàn toàn các chất nền. Dựng dung dịch (NH4)2SO4 bóo hũa để biến tớnh protein, mẫu sữa với (NH4)2SO4 bóo hũa với tỷ lệ 3 : 2.

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

47

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

LEV đƣợc xác định dựa trờn phản ứng cạnh tranh giữa LEV tự do cú trong mẫu (hoặc dung dịch chuẩn) và LEV ở dạng phức hợp LEV-OVA gắn trờn phiến nhựa với kháng thể đa dũng kháng LEV tạo miễn dịch trong thỏ. Lƣợng pAb đó tham gia vào phản ứng cạnh tranh đƣợc xác định thụng qua lƣợng cộng hợp kháng thể thứ 2 kháng pAb (rabbit anti-mouse IgG, HRP conjugate -rAnti-IgG-HRP) sử dụng trong phản ứng ELISA gián tiếp. Lƣợng enzym liờn kết với kháng thể thứ 2 đƣợc xác định bằng phản ứng lờn màu với cơ chất TMB. Xác định lƣợng LEV thụng qua cƣờng độ màu đo đƣợc ở bƣớc súng 450 nm trờn máy đọc ELISA.

Để thực hiện đƣợc nội dung trờn, tiến hành các thớ nghiệm sau:

- Trƣớc tiờn phải tổng hợp phức hợp LEV gắn với protein OVA/BSA. LEV- OVA đƣợc sử dụng trong phản ứng gắn kháng nguyờn LEV lờn phiến nhựa, LEV-BSA đƣợc sử dụng gõy miễn dịch tạo kháng thể đa dũng kháng LEV trờn thỏ.

- Gõy miễn dịch trờn thỏ tạo kháng thể đa dũng kháng LEV-BSA.

- Tối ƣu các điều kiện phản ứng ELISA cụ thể: Nồng độ LEV-OVA gắn lờn phiến nhựa, độ pha loóng pAb kháng LEV, độ pha loóng cộng hợp kháng thể thứ 2 (rAnti-IgG-HRP).

- Tiến hành xõy dựng đƣờng chuẩn ELISA gián tiếp xác định LEV trong đệm, trong sữa, đánh giá hiệu suất thu hồi, khả năng phản ứng chộo với các kháng sinh cựng họ Fluoroquilone.

- Xác định LEV trong một số mẫu sữa.

Trong nghiờn cứu này, do LEV là kháng sinh cú trọng lƣợng phõn tử nhỏ nờn khụng cú khả năng gõy miễn dịch tạo kháng thể. Vỡ thế, các phõn tử nhỏ muốn sử dụng trong mục đớch gõy miễn dịch phải đƣợc gắn với một phõn tử cú trọng lƣợng

Số hoỏ bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

48

phõn tử lớn (phõn tử protein). Chỳng tụi tiến hành gắn LEV với BSA, ở dạng liờn kết này phức hợp cú khả năng tạo miễn dịch trờn thỏ.

Bề mặt giếng ELISA cú bản chất polystyren cú khả năng gắn các protein, chớnh vỡ vậy, muốn gắn LEV lờn bề mặt giếng, trƣớc tiờn LEV cần đƣợc gắn với phõn tử protein (OVA). Ở dạng phức hợp này, OVA sẽ gắn lờn bề mặt giếng ELISA, phần LEV sẽ đƣợc bộ lộ trờn bề mặt giếng, vừa đảm bảo đƣợc gắn lờn giếng, vừa đảm bảo vị trớ khụng gian của nú trờn bề mặt giếng cho phộp liờn kết đặc hiệu với kháng thể đa dũng kháng LEV.

3.1. Các thụng sụ́ phản ứng ELISA gián tiếp

- Nồng độ phức hợp kháng nguyờn (LEV - OVA) đƣợc sử dụng là 0,5 àg/ml - Độ pha loóng kháng thể đa dũng kháng LEV thớch hợp: 5.000 x lần.

- Độ pha loóng cộng hợp kháng thể thứ 2 (rAnti-IgG-HRP): 10.000 x lần.

(Cỏc thớ nghiệm này được tiến hành tại phũng thớ nghiệm của GS Eremin, phũng thớ nghiệm Húa enzyme, Khoa Húa, Trường ĐH Quốc gia Lomonosov, CHLB Nga).

3.2. Kết quả phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp

í nghĩa của phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp ở đõy đƣợc thể hiện qua 2 tiờu chớ:

- Cạnh tranh: Kháng nguyờn tự do cú trong mẫu và kháng nguyờn cố định trờn phiến ELISA cạnh tranh với nhau trong liờn kết đặc hiệu với kháng thể đa dũng kháng LEV.

- Gián tiếp: Phản ứng phát hiện kháng thể thứ 2 (là kháng thể kháng huyết thanh thỏ tạo trong chuột) ở dạng cộng hợp, chứ khụng phát hiện trực tiếp kháng thể đa dũng kháng LEV.

Thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp để xõy dựng đồ thị chuẩn xác định hàm