3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Tổng số 22 điểm thu mẫu dơi và ruồi ký sinh ở dơi được tiến hành ở 3 khu vực nghiên cứu. Trong đó, 10 điểm ở VQG Cát Bà (xã Trân Châu), 4 điểm ở KRĐD Sốp Cộp (xã Sốp Cộp), 8 điểm ở KBTB Cù Lao Chàm (xã Tân Hiệp). Các điểm thu mẫu tập trung ở VQG Cát Bà vì sự đa dạng hơn về thành phần loài dơi so với hai khu vực còn lại [1], [2], [4], [5].
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong hai năm từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 10 năm 2017, các đợt thu mẫu ruồi ký sinh ở dơi tại mỗi địa điểm nghiên cứu được tiến hành như sau:
KRĐD Sốp Cộp: tháng 7/2017;
VQG Cát Bà: tháng 8/2015, tháng 10/2016;
KBTB Cù Lao Chàm: tháng 5 - tháng 6/2015, tháng 6 - tháng 7/2016. Thời gian còn lại, tác giả tiến hành thu thập tài liệu, phân tích mẫu vật, xử lý số liệu và viết báo cáo.
2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Vật liệu 2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Mẫu vật nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên kết quả phân tích và định loại 40 cá thể ruồi ký sinh thu được ở 131 cá thể dơi. Trong đó có 24 cá thể ruồi thu được ở VQG Cát Bà, 13 mẫu vật thu được ở KRĐD Sốp Cộp, 3 cá thể thu được ở KBTB Cù Lao Chàm. Các mẫu vật hiện được lưu trữ trong các tuýp bằng nhựa hoặc thủy tinh ở phòng Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1.2. Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị thu mẫu dơi gồm có: lưới mờ, bẫy thụ cầm, vợt cầm tay, thước kẹp Panme, kính lúp cầm tay, túi đựng, găng tay, dụng cụ chứa mẫu (bình nhựa hoặc thủy tinh), máy ảnh, máy ghi siêu âm.
Thiết bị thu mẫu ruồi ký sinh gồm có: cồn tuyệt đối 90%, chlorofom, tăm bông, găng tay y tế, tuýp đựng mẫu (bằng nhựa hoặc thủy tinh), kính lúp soi nổi, giấy ghi nhãn, bút ghi nhãn (mực không phai trong cồn), đĩa petri, kẹp mẫu, sổ ghi thực địa, GPS (Garmin, Japan)... , và nhiều thiết bị để tách chiết trong phân tích DNA.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Thu và định loại vật chủ dơi
Các điểm thu mẫu ruồi ký sinh ở dơi dựa vào khu vực phân bố của dơi chủ yếu như: hang núi đá vôi, vườn cây ăn quả, rìa sông suối, rừng trồng, ao hồ, rừng ngập mặn.
Phương pháp thu mẫu dơi trên thực địa được thực hiện theo Vũ Đình Thống và Neil M. Furey (2008) [2], Vũ Đình Thống (2013) [3], Vũ Đình Thống và cs. (2015), (2016) [4], [5], [54]. Dơi được bắt bằng bẫy thụ cầm (kích thước 1,2 x 1,5 m, bao gồm 4 khung kim loại) và lưới mờ có kích thước khác nhau (12,0 x 2,4 m; 12,0 x 4,0 m; 6,0 x 2,4 m; 6 x 3,2 m; 3,0 x 3,2 m; 3,0 x 2,4 m). Những thiết bị này được giăng trước cửa hang động nhỏ, lối mòn và suối cạn thuộc khu vực nghiên cứu. Bẫy và lưới được mở và kiểm tra thường xuyên trong suốt khoảng thời gian từ khoảng 17h00 đến 22h30 hàng ngày để bắt kịp thời, tránh gây tổn thương đối với dơi. Sau khi định loại sơ bộ và thu mẫu ruồi ký sinh trên thực địa, một số cá thể trưởng thành thuộc mỗi loài được giữ lại làm mẫu vật nghiên cứu ở Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Những cá thể cái đang trong thời kỳ mang thai hoặc cho con non bú được thả ngay sau khi bắt từ bẫy hoặc lưới, đảm bảo tính nhân đạo trong nghiên cứu động vật hoang dã, không gây ảnh hưởng đến con non và tỷ lệ sinh sản của dơi ở khu vực nghiên cứu [4], [54].
2.3.2.2. Thu mẫu ruồi ký sinh
Mẫu ruồi ký sinh được thu bằng cách sử dụng tăm bông thấm đều chloroform lên vùng lông của dơi có quan sát thấy ruồi ký sinh; phổ biến ở gốc lông phần nách, sau loa tai và mặt dưới màng cánh. Tất cả các mẫu được bảo quản trong ống nhựa hoặc thủy tinh chứa cồn 70% theo Hutson (1984) [14]. Mẫu ruồi ký sinh thu được ở mỗi cá thể dơi được gắn ê-ti-ket và bảo quản riêng trong từng ống nghiệm tại Phòng Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Trong phạm vi của nghiên cứu này chỉ tập trung nghiên cứu và định loại những mẫu ruồi ký sinh trưởng thành.
2.3.2.3. Xử lý mẫu vật trong phòng thí nghiệm
Phương pháp phân tích mẫu vật và xử lý hình ảnh
Các mẫu vật ruồi ký sinh ở dơi được cố định trong các lọ cồn 70%. Sau khi làm sạch bằng dung dịch KOH, ruồi ký sinh được đưa ra đĩa petri trong đó có chứa cát mịn để giữ cho bề mặt của mẫu vật luôn ẩm ướt và cố định vị trí quan sát. Mẫu vật được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1270 để mô tả các đặc điểm hình thái. Việc định loại căn cứ vào mô tả và minh họa trong những tài liệu đã công bố có ghi nhận về các loài ngoại ký sinh ở dơi của Việt Nam và các nước lân cận [17], [35], [42], [46], [50], [51], [53].
Bộ máy xử lý hình ảnh gồm: Kính hiển vi soi nổi Nikon AZ100 kết nối với máy ảnh siêu room Nikon NY1S. Mỗi ảnh được chụp tương ứng với một độ phân giải khác nhau thông qua kính hiển vi. Xử lý chồng ảnh bằng phần mềm photoshop Helicon Focus 6 bản Pro unlimited trên hệ điều hành Window 10 professional.
Tách chiết DNA
Mối quan hệ di truyền của các loài ruồi ký sinh ở các khu vực nghiên cứu được xây dựng dựa trên cây phát sinh chủng loại bằng phân tích gen COI.
Một đoạn chân được lấy từ ruồi ký sinh, dùng làm mẫu tách chiết DNA. Mẫu tách chiết được rửa sạch bằng canxi, khử trùng bằng 500 μL TE (pH 8,0) trong một đĩa nhựa dùng một lần, bộ gaster bị phá vỡ một phần bằng kẹp khử trùng. Toàn bộ sản phẩm tách chiết được chuyển vào 105 μL buồng trích ly (100 μL 10% dung dịch Chelex-TE và 5 μl Qiagen Proteinase K) và ủ ở 56oC trong 24 giờ, sau đó được giữ nhiệt độ ở 99oC trong 10 phút để ngừng hoạt động Qiagen Proteinase K trong buồng trích ly.
Khoảng 658 bp của vùng mã vạch DNA tiêu chuẩn gần đầu 5' của gen COI (gen ti thể) được khuếch đại bằng cách sử dụng bộ mồi LCO-EG/HCO-EG (Eguchi et. al. (2016)):
TTTCAACAAATCACAAAGAYATYGG, TAAACTTCAGGRTGACCRAAAAATCA.
Mỗi chu trình PCR chứa 5 μL dung môi 2xPCR, 2 μL dNTPs (0.4 mM), 0.3 μL 10 pmol/μL về phía trước và mồi ngược (0.3 μm kết thúc), 0.2 μL 1.0 U/μL DNA polymerase (KOD FX Neo TOYOBO KFX-2015), và 1,0 μL mẫu DNA. Chế độ nhiệt PCR bao gồm một chu trình 2 phút ở 94°C; 5 chu kỳ với 10 giây ở 98°C, 30 giây ở 45°C và 45 giây ở 68°C; 40 chu kỳ với 10 giây ở 98°C, 30 giây ở 48,5°C và 45 giây ở 68°C; và một chu kỳ cuối 7 phút ở 68°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2.0%, sau đó được ủ ở 37°C trong 15 phút và 80°C trong 15 phút để loại bỏ các đoạn mồi và các nucleotide còn sót lại. Giải trình tự sử dụng máy giải trình tự tự động ABI
PRISM 3100. Trình tự ADN được đọc và phân tích sử dụng phần mềm ChromasPro 1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) và MEGA 7 (Kumar và cs., 2016).
Chỉ số khoảng cách di truyền p-distance (tỉ lệ số lượng nucleotide khác nhau trên tổng số nucleotide được so sánh) được xây dựng và phân tích sử dụng phần mền Mega 7. Cây phát sinh dựa trên mô hình khoảng cách K2P được tạo ra thông qua phần mềm MEGA 7.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. THÀNH PHẦN LOÀI RUỒI KÝ SINH Ở DƠI GHI NHẬN ĐƯỢC TRONG CÁC KHU VỰC NGHIÊN CỨU TRONG CÁC KHU VỰC NGHIÊN CỨU
Cho đến nay, đã ghi nhận ở VQG Cát Bà, KRĐD Sốp Cộp, KBTB Cù Lao Chàm có 12 loài thuộc 7 giống ruồi ký sinh ở dơi: Nycteribia sp., Basilia roylii, Basilia pundibunda, Basilia burmensis, Basilia majuscula, Leptocyclopodia ferrari, Cyclopodia horsfieldi, Ascodipteron phyllorhinae, Ascodipteron wenzeli, Brachytarsina amboinensis, Brachytarsina cucullata, Maabella stomalata. Trong đó, có 6 loài mới ghi nhận ở Việt Nam: Nycteribia sp., Basilia roylii, Basilia burmensis, Basilia majuscula, Basilia pundibunda, Cyclopodia horsfieldi
(họ Nycteribiidae), 1 loài thuộc họ Streblidae: Brachytarsina cucullata. Kết quả về thành phần loài và địa điểm ghi nhận ruồi ký sinh (Diptera: Streblidae, Nycteribiidae) ở khu vực nghiên cứu được tổng kết ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh sách và địa điểm ghi nhận ruồi ký sinh ở dơi trong các KVNC
S T
T Thành phần loài ruồi ký sinh Vật chủ
Địa điểm ghi nhận VQ GCB K R ĐD S C KBTB C LC Liên họ HIPPOBOSCOIDAE Họ NYCTERIBIIDAE Westwood, 1840
1 Nycteribia sp.* Rhinlophus pusillus +
2 Basilia roylii (Westwood, 1835)* Hipposideros alongensis + +
Rhinlophus pusillus
3 Basilia pundibunda Schuurmans Stekhoven, 1941* Myotis fuliginosus R. pusillus + + H. alongensis H. khaokhouayensis
4 Basilia burmensis (Theodor, 1954)* H. grandis +
5 Basilia majuscula (Edwards, 1919) Myotis annectans +
6 Leptocyclopodia ferrari Rondani, 1878 Myotis annectans +
7 Cyclopodia horsfieldi de Mejeire, 1899* Cynopterus horsfieldii + +
Myotis annectans
Họ STREBLIDAE Kolenati, 1863
8 Ascodipteron phyllorhinae Adensamer, 1896 Hypsugo pulveratus +
9 Ascodipteron wenzeli Hastriter, 2007 H. pomona +
R. pusillus
11 Brachytarsina cucullata (Jobling, 1934)* R. marshalli + +
R. pusillus
12 Maabella stomalata Hastriter et Bush, 2006 H. khaokhouayensis +
Tổng số loài 8 6 3
*: loài mới ghi nhận ở Việt Nam. VQGCB: Vườn Quốc gia Cát Bà, KRĐDSC: Khu Rừng đặc dụng Sốp Cộp, KBTBCLC: Khu Bảo tồn biển Cù Lao Chàm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, họ Nycteribiidae có 7 loài, có số lượng loài nhiều hơn so với họ Streblidae (5 loài) tại KVNC. Trong đó, giống Basilia có 4 loài (33,33%) chiếm ưu thế tuyệt đối trong danh sách, điều này hoàn toàn phù hợp vì các loài trong giống đều có phân bố rộng trong khu vực và trên thế giới. Tiếp đến là giống Ascodipteron và Brachytarsina; mỗi giống chỉ có 2 loài (16,67%), các loài trong giống này đều đã có ghi nhận tại Hà Tĩnh (Vũ Quang), Tuyên Quang (Na Hang) [16], [19]. Các giống còn lại (Nycteribia, Leptocyclopodia, Cyclopodia, Maabella)mỗi giống chỉ có 1 loài, chiếm 8,33%.
Tỷ lệ các loài ruồi ký sinh không cánh (Nycteribiidae) và các loài ruồi ký sinh có cánh (Streblidae) cân bằng ở khu vực nghiên cứu. Có 7 loài (Nycteribia
sp., Basilia roylii, Basilia pundibunda, Basilia burmensis, Basilia majuscula, Leptocyclopodia ferrari, Cyclopodia horsfieldi)thuộc họ Nycteribiidae và 5 loài (Ascodipteron phyllorhinae, Ascodipteron wenzeli, Brachytarsina amboinensis, Brachytarsina cucullata, Maabella stomalata) thuộc họ Streblidae. Tỷ lệ này không chênh lệch bằng khu hệ Vũ Quang (Hà Tĩnh) nhưng cao hơn các khu hệ miền Trung và Tây Nguyên [17], [20], [21]. Hầu hết các loài ruồi ký sinh ở dơi ở khu vực nghiên cứu là các loài đã ghi nhận ở Việt Nam và các nước lân cận.
Tổng số 5 loài ruồi ký sinh ở dơi phân bố ở hai trong ba khu vực nghiên cứu (bảng 3.1). Trong đó có 2 loài cùng phân bố ở VQG Cát Bà và KBTB Cù Lao Chàm, 2 loài cùng phân bố ở KRĐD Sốp Cộp và VQG Cát Bà, 1 loài cùng phân bố ở KRĐD Sốp Cộp và KBTB Cù Lao Chàm. Đây cũng là những loài có ghi nhận phân bố rộng trong khu vực, điều này cũng phù hợp với sự phân bố của các vật chủ dơi. Số lượng loài ruồi ký sinh ở các khu vực nghiên cứu chênh lệch không lớn. VQG Cát Bà có số lượng loài lớn nhất (8 loài), tiếp theo là KRĐD Sốp
Cộp (6 loài), KBTB Cù Lao Chàm chỉ có 3 loài. Những nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra VQG Cát Bà có số lượng các loài dơi phong phú hơn so với các khu vực còn lại. Tuy nhiên, các xét nghiệm trên 131 vật chủ dơi ở 3 khu vực nghiên cứu mới chỉ là những ghi nhận bước đầu.
Kết quả phân tích trình tự DNA trên đoạn gen COI kích thước 658bp, cho thấy mối quan hệ của 12 loài ruồi ký sinh ở dơi trong các KVNC (hình 3.1). Kết quả này tương tự với kết quả phân tích các đặc điểm hình thái trong phân loại học.
Hình 3.1. Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa một số nhóm loài ở KVNC (Nhóm A: các loài ruồi ký sinh không có cánh, nhóm B: các loài ruồi ký sinh có cánh)
Kết quả cho thấy các loài ruồi ký sinh ở dơi tại KVNC được chia thành hai nhóm lớn. Nhóm A bao gồm các loài ruồi ký sinh không có cánh: Nycteribia
sp., Basilia roylii, Basilia pundibunda, Basilia burmensis, Basilia majuscula, Leptocyclopodia ferrari, Cyclopodia horsfieldi. Nhánh 1 chỉ có loài Basilia pundibunda thể hiện sự giống nhau về mặt di truyền của các cá thể cùng loài. Giữa
nhánh 1 và nhánh 2 có sự khác biệt giữa các giống Basilia và Leptocyclopodia,
Cyclopodia. Ngay trong một nhánh, loài Leptocyclopodia ferrari và loài
Cyclopodia horsfieldi được tách thành hai nhánh riêng biệt. Nhánh 3 có quan hệ không gần gũi với hai nhánh trên nhưng lại thể hiện sự rõ gần gũi trong quan hệ của loài Basilia majuscula. Đáng lưu ý, loài Nycteribia sp. cũng nằm trong nhánh này nhưng hoàn toàn tách ra một nhánh nhỏ so với Basilia majuscula.
Nhóm B gồm các loài ruồi ký sinh có cánh: Ascodipteron phyllorhinae, Ascodipteron wenzeli, Brachytarsina amboinensis, Brachytarsina cucullata, Maabella stomalata. Các loài Ascodipteron phyllorhinae, Ascodipteron wenzeli, Brachytarsina amboinensis, Brachytarsina cucullata được xếp riêng một nhánh. Chỉ riêng loài Maabella stomalata bị tách thành một nhánh độc lập.
Như vậy, phần lớn các loài được phân tích di truyền đã được ghi nhận ở Việt Nam, việc phân tích gen COI có thể phù hợp với một nhóm loài mà không đặc hiệu với những nhóm loài khác.
Họ NYCTERIBIIDAE
Giống Nycteribia Latreille, 1976 a) Nycteribia sp.
Vật chủ:Rhinolophus pusillus (họ Rhinolophidae), mã số DC.22062014.2
Vật mẫu nghiên cứu: Mã số: EC.22062014.2 (♂), địa điểm: Sơn La (KRĐD Sốp Cộp).
Mô tả:
Thân dài từ 3,0 - 5,0 mm. Cơ thể màu nâu, dẹt theo hướng lưng-bụng. Đầu: Dạng thon dài. Phía trên đỉnh đầu có 2 lông dài, xung quanh được phủ nhiều lông ngắn. Hai mắt màu đen, cách xa nhau. Hai hàng 6-8 lông setae xếp phía sau đầu tạo thành khoảng trống ở giữa. Labella của vòi hút ngắn hơn so với theca (hình 3.2C).
Ngực: Dạng dẹt, khoảng cách bề ngang lớn hơn khoảng cách chiều dài của phần ngực. Trên ngực có hai rãnh chéo nhau một góc 95o là phần thân của
mesopleural sutures và mesonotum là notopleural suture, đây là đường màu nâu sẫm xuất phát từ phía cơ quan thăng bằng (haltere) kéo dài về phía đầu. Trên phần thân mesopleural sutures có từ 6 - 11 lông cứng xếp thành hàng. Đỉnh nhọn mesopleural sutures phát triển mạnh về phía gắn các đôi chân trên phần ngực. Cẳng chân hình ống, chiều dài gấp 4 - 5 lần chiều rộng, trên đó có nhiều lông mềm (hình 3.2A, 3.2B).
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của loài Nycteribia sp.(A: mặt lưng, B: mặt bụng, C: đầu, D: cơ quan sinh dục đực, thước tỷ lệ 0,5 mm)
Bụng
Bụng con đực: Phần bụng ngắn, đốt ngực thứ nhất lõm về phía sau có một hàng lông hoặc gai ngắn ở phía trên. Trên đốt bụng thứ 2 và thứ 3 được xếp các hàng lông có kích thước ngắn hoặc trung bình. Đốt bụng thứ 4 đến thứ 6 ngắn có 2 - 4 lông dài xen vào giữa hàng lông có độ dài trung bình. Hậu môn hình nón, mặt dưới được che bởi một hàng lông mềm. Phía mặt dưới, các tấm sternite 1+2 rộng hơn các tấm còn lại, ngăn cách với tấm sternite thứ 3 bởi một hàng khoảng 45 lông ctenidium rất cứng, màu đen; tấm sternite thứ 4 chỉ có một hàng gai
0,5 mm
A B C
ngắn và nhọn cho đến rất nhọn. Tấm Sternite thứ 5 được xếp hai hàng khoảng 15 gai ngắn ở rìa sau (hình 3.2A, 3.2B).
Bộ phận sinh dục đực: Dài bằng 2/3 chiều dài phần bụng. Bao gồm hai nhánh clasper màu vàng nhạt, mảnh hơn ở các loài cùng giống Nycteribia, hơi cong xuống phía bụng nhưng không cong bằng các loài thuộc giống Basilia, dương vật (aedeagus) ngắn ẩn bên dưới clasper và nằm chính giữa hai paramere hình bầu dục, nhọn về phía đỉnh (hình 3.2D).
Phân bố:
Việt Nam: Sơn La (Sốp Cộp)
Ghi chú: Trong nghiên cứu này, mẫu vật nghiên cứu Nycteibia sp. gồm 1 cá thể đực ở loài dơi Rhinolophus pusillus, Nycteribia sp. là loài mới ghi nhận cho khu hệ ruồi ký sinh ở dơi ở Việt Nam.
Giống Basilia Miranda Ribeiro, 1903 b) Basilia roylii (Westwood, 1835) Synonym:
Nycteria roylii Westwood, 1835
Cyclopodia roylii (Westwood, 1835)
Paracyclopodia roylii (Westwood, 1835)
Basilia (Paracyclopodia) roylii (Westwood, 1835)
Vật chủ: Hipposideros alongensis (họ Hipposideridae), mã số: T.300915.1;
Rhinolophus pusillus (họ Rhinolophidae), mã số: T.180717.2
Vật mẫu nghiên cứu: EC.300915.1 (♀), địa điểm: Hải Phòng (Cát Bà); EC.180717.2 (♂), địa điểm: Quảng Nam (Cù Lao Chàm).
Mô tả: