CHƯƠNG 2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, VẬT LIỆU
2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Mẫu vật nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên kết quả phân tích và định loại 40 cá thể ruồi ký sinh thu được ở 131 cá thể dơi. Trong đó có 24 cá thể ruồi thu được ở VQG Cát Bà, 13 mẫu vật thu được ở KRĐD Sốp Cộp, 3 cá thể thu được ở KBTB Cù Lao Chàm. Các mẫu vật hiện được lưu trữ trong các tuýp bằng nhựa hoặc thủy tinh ở phòng Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1.2. Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị thu mẫu dơi gồm có: lưới mờ, bẫy thụ cầm, vợt cầm tay, thước kẹp Panme, kính lúp cầm tay, túi đựng, găng tay, dụng cụ chứa mẫu (bình nhựa hoặc thủy tinh), máy ảnh, máy ghi siêu âm.
Thiết bị thu mẫu ruồi ký sinh gồm có: cồn tuyệt đối 90%, chlorofom, tăm bông, găng tay y tế, tuýp đựng mẫu (bằng nhựa hoặc thủy tinh), kính lúp soi nổi, giấy ghi nhãn, bút ghi nhãn (mực không phai trong cồn), đĩa petri, kẹp mẫu, sổ ghi thực địa, GPS (Garmin, Japan)... , và nhiều thiết bị để tách chiết trong phân tích DNA.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Thu và định loại vật chủ dơi
Các điểm thu mẫu ruồi ký sinh ở dơi dựa vào khu vực phân bố của dơi chủ yếu như: hang núi đá vôi, vườn cây ăn quả, rìa sông suối, rừng trồng, ao hồ, rừng ngập mặn.
Phương pháp thu mẫu dơi trên thực địa được thực hiện theo Vũ Đình Thống và Neil M. Furey (2008) [2], Vũ Đình Thống (2013) [3], Vũ Đình Thống và cs. (2015), (2016) [4], [5], [54]. Dơi được bắt bằng bẫy thụ cầm (kích thước 1,2 x 1,5 m, bao gồm 4 khung kim loại) và lưới mờ có kích thước khác nhau (12,0 x 2,4 m; 12,0 x 4,0 m; 6,0 x 2,4 m; 6 x 3,2 m; 3,0 x 3,2 m; 3,0 x 2,4 m). Những thiết bị này được giăng trước cửa hang động nhỏ, lối mòn và suối cạn thuộc khu vực nghiên cứu. Bẫy và lưới được mở và kiểm tra thường xuyên trong suốt khoảng thời gian từ khoảng 17h00 đến 22h30 hàng ngày để bắt kịp thời, tránh gây tổn thương đối với dơi. Sau khi định loại sơ bộ và thu mẫu ruồi ký sinh trên thực địa, một số cá thể trưởng thành thuộc mỗi loài được giữ lại làm mẫu vật nghiên cứu ở Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Những cá thể cái đang trong thời kỳ mang thai hoặc cho con non bú được thả ngay sau khi bắt từ bẫy hoặc lưới, đảm bảo tính nhân đạo trong nghiên cứu động vật hoang dã, không gây ảnh hưởng đến con non và tỷ lệ sinh sản của dơi ở khu vực nghiên cứu [4], [54].
2.3.2.2. Thu mẫu ruồi ký sinh
Mẫu ruồi ký sinh được thu bằng cách sử dụng tăm bông thấm đều chloroform lên vùng lông của dơi có quan sát thấy ruồi ký sinh; phổ biến ở gốc lông phần nách, sau loa tai và mặt dưới màng cánh. Tất cả các mẫu được bảo quản trong ống nhựa hoặc thủy tinh chứa cồn 70% theo Hutson (1984) [14]. Mẫu ruồi ký sinh thu được ở mỗi cá thể dơi được gắn ê-ti-ket và bảo quản riêng trong từng ống nghiệm tại Phòng Bảo tàng Động vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Trong phạm vi của nghiên cứu này chỉ tập trung nghiên cứu và định loại những mẫu ruồi ký sinh trưởng thành.
2.3.2.3. Xử lý mẫu vật trong phòng thí nghiệm
Phương pháp phân tích mẫu vật và xử lý hình ảnh
Các mẫu vật ruồi ký sinh ở dơi được cố định trong các lọ cồn 70%. Sau khi làm sạch bằng dung dịch KOH, ruồi ký sinh được đưa ra đĩa petri trong đó có chứa cát mịn để giữ cho bề mặt của mẫu vật luôn ẩm ướt và cố định vị trí quan sát. Mẫu vật được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1270 để mô tả các đặc điểm hình thái. Việc định loại căn cứ vào mô tả và minh họa trong những tài liệu đã công bố có ghi nhận về các loài ngoại ký sinh ở dơi của Việt Nam và các nước lân cận [17], [35], [42], [46], [50], [51], [53].
Bộ máy xử lý hình ảnh gồm: Kính hiển vi soi nổi Nikon AZ100 kết nối với máy ảnh siêu room Nikon NY1S. Mỗi ảnh được chụp tương ứng với một độ phân giải khác nhau thông qua kính hiển vi. Xử lý chồng ảnh bằng phần mềm photoshop Helicon Focus 6 bản Pro unlimited trên hệ điều hành Window 10 professional.
Tách chiết DNA
Mối quan hệ di truyền của các loài ruồi ký sinh ở các khu vực nghiên cứu được xây dựng dựa trên cây phát sinh chủng loại bằng phân tích gen COI.
Một đoạn chân được lấy từ ruồi ký sinh, dùng làm mẫu tách chiết DNA. Mẫu tách chiết được rửa sạch bằng canxi, khử trùng bằng 500 μL TE (pH 8,0) trong một đĩa nhựa dùng một lần, bộ gaster bị phá vỡ một phần bằng kẹp khử trùng. Toàn bộ sản phẩm tách chiết được chuyển vào 105 μL buồng trích ly (100 μL 10% dung dịch Chelex-TE và 5 μl Qiagen Proteinase K) và ủ ở 56oC trong 24 giờ, sau đó được giữ nhiệt độ ở 99oC trong 10 phút để ngừng hoạt động Qiagen Proteinase K trong buồng trích ly.
Khoảng 658 bp của vùng mã vạch DNA tiêu chuẩn gần đầu 5' của gen COI (gen ti thể) được khuếch đại bằng cách sử dụng bộ mồi LCO-EG/HCO-EG (Eguchi et. al. (2016)):
TTTCAACAAATCACAAAGAYATYGG, TAAACTTCAGGRTGACCRAAAAATCA.
Mỗi chu trình PCR chứa 5 μL dung môi 2xPCR, 2 μL dNTPs (0.4 mM), 0.3 μL 10 pmol/μL về phía trước và mồi ngược (0.3 μm kết thúc), 0.2 μL 1.0 U/μL DNA polymerase (KOD FX Neo TOYOBO KFX-2015), và 1,0 μL mẫu DNA. Chế độ nhiệt PCR bao gồm một chu trình 2 phút ở 94°C; 5 chu kỳ với 10 giây ở 98°C, 30 giây ở 45°C và 45 giây ở 68°C; 40 chu kỳ với 10 giây ở 98°C, 30 giây ở 48,5°C và 45 giây ở 68°C; và một chu kỳ cuối 7 phút ở 68°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2.0%, sau đó được ủ ở 37°C trong 15 phút và 80°C trong 15 phút để loại bỏ các đoạn mồi và các nucleotide còn sót lại. Giải trình tự sử dụng máy giải trình tự tự động ABI
PRISM 3100. Trình tự ADN được đọc và phân tích sử dụng phần mềm ChromasPro 1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) và MEGA 7 (Kumar và cs., 2016).
Chỉ số khoảng cách di truyền p-distance (tỉ lệ số lượng nucleotide khác nhau trên tổng số nucleotide được so sánh) được xây dựng và phân tích sử dụng phần mền Mega 7. Cây phát sinh dựa trên mô hình khoảng cách K2P được tạo ra thông qua phần mềm MEGA 7.